分子克隆(molecular cloning)又稱為基因克隆、基因工程、DNA克隆、重組DNA技術(shù)。DNA重組技術(shù)是20世紀(jì)70年代初興起的技術(shù)，目的是將不同的DNA片段按照人們的設(shè)計定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀。而載體是一種運輸工具，它將一個有用的目的DNA片段通過DNA重組技術(shù)，遞送至受體細(xì)胞進行繁殖或表達(dá)。在基礎(chǔ)研究中，常用的載體是質(zhì)粒和病毒。
質(zhì)粒
質(zhì)粒(plasmid)是一種獨立于染色體外的穩(wěn)定的遺傳因子，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中，大小從1-200kb不等。它主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，但是需要依賴宿主細(xì)胞編碼的酶和蛋白。它能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。
質(zhì)粒按照功能可以分為克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒。作為理想的克隆質(zhì)粒，質(zhì)粒需要具備以下條件：①一個復(fù)制起點ori(replication origin)，這是質(zhì)粒自我復(fù)制必不可少的基本條件；②一個或者多個選擇性標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因；③多克隆位點：外源基因插入后不影響質(zhì)粒的復(fù)制；④分子量小，易于操作，插入外源基因后仍可有效遞送至受體細(xì)胞；⑤拷貝數(shù)多，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴增；⑥具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。下圖是克隆質(zhì)粒的圖譜：
相對于克隆質(zhì)粒，一個表達(dá)質(zhì)粒所包含的元件要更復(fù)雜。下面是表達(dá)質(zhì)粒的圖譜和常見元件：
|
元件
|
描述
|
|
復(fù)制起始(ori)
|
有利于質(zhì)粒自我繁殖。
|
|
抗生素抗性基因
|
為了方便篩選在細(xì)菌中擴增得到的質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒中需要添加便于篩選的抗生素抗性基因。常使用的抗性基因包括：Ampicillin、Kanamycin、Hygromycin B、Spectinomycin、Tetracycline等等。
|
|
多克隆位點（MCS）
|
MCS是包含幾個限制性酶切位點的DNA短片段，可以通過限制性酶進行酶切連接插入外源DNA。在表達(dá)質(zhì)粒中，MCS通常位于啟動子的下游，且限制性酶切位點是唯一的，不存在于質(zhì)粒其他位置。
|
|
插入片段
|
插入片段是克隆到MCS中的基因，啟動子或其他DNA片段。 插入片段通常是進行特定研究的遺傳元件。
|
|
啟動子
|
驅(qū)動插入DNA片段進行轉(zhuǎn)錄。啟動子招募特定生物的相關(guān)轉(zhuǎn)錄機制。特定生物可以選擇特定的啟動子；另外，啟動子還可以指導(dǎo)細(xì)胞特異性表達(dá)，通過組織特異性啟動子來實現(xiàn)。啟動子的強度對于插入DNA片段的表達(dá)水平也很重要（即強啟動子能夠使插入DNA片段高表達(dá)，而弱啟動子則可以使插入DNA片段呈現(xiàn)內(nèi)源性表達(dá)水平）。
|
|
選擇性標(biāo)記
|
選擇標(biāo)記通常以非細(xì)菌啟動子控制的抗生素抗性基因或熒光蛋白的形式存在。作為選擇性標(biāo)記，在遺傳選擇和篩選檢測方面都能夠便于實驗中的測定。
|
|
引物結(jié)合位點
|
此序列有利于檢測插入基因的正確性和質(zhì)粒上其他區(qū)域序列的正確性。
|
病毒：
對于轉(zhuǎn)染困難的細(xì)胞，科研工作者通常會選擇病毒來導(dǎo)入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具，請參考下面3種病毒工具的比較：
|
病毒表達(dá)系統(tǒng)
|
腺病毒
|
腺相關(guān)病毒
|
慢病毒
|
|
病毒基因組
|
dsDNA
|
ssDNA
|
ssRNA
|
|
病毒外殼
|
無
|
無
|
具有包膜蛋白
|
|
基因組大小
|
38-39kb
|
5kb
|
9kb
|
|
包裝容量
|
7.5kb
|
4.7kb
|
6kb
|
|
感染的細(xì)胞類型
|
分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞
|
分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞
|
分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞
|
|
整合至宿主基因組
|
非整合
|
非整合
|
整合
|
|
表達(dá)豐度
|
高水平表達(dá)
|
高水平表達(dá)
|
中到高水平表達(dá)
|
|
表達(dá)時間
|
快（1-2天）
|
1-2周（體內(nèi)）
|
慢（2-4天）
|
|
外源基因持續(xù)表達(dá)時間
|
短暫
|
潛在的持久
|
長久
|
|
免疫反應(yīng)
|
較高
|
極低
|
低
|
|
相對病毒滴度
|
10E10pfu/mL
|
10E13VG/mL
|
10E8TU/mL
|
|
生物安全等級
|
BSL-2
|
BSL-2
|
BSL-2
|
質(zhì)粒憑借操作簡單、易于制備、性能穩(wěn)定和用途廣泛等特點已成為分子生物學(xué)的基本工具。因此，分子克隆技術(shù)已成為每個科研工作者必備的一項技能。它雖然簡單，卻很花時間。維真生物是您不二的選擇，主要有以下幾點特色：
|
1.
|
維真生物擁有2大人源基因質(zhì)粒庫，包括人源ORF cDNA克隆和人源microRNA克隆?；蚰０蹇梢灾苯佑矛F(xiàn)成的，省去了獲得模板的煩惱；
|
|
2.
|
維真生物的技術(shù)團隊擁有豐富的克隆經(jīng)驗，只要您提出實驗需求，我們就可出具相應(yīng)的實驗方案，將您的實驗需求落地；
|
|
3.
|
無論您的目的是哪一種(蛋白編碼基因、lncRNAs、microRNAs、circRNA和啟動子等調(diào)控序列)，維真生物均不在話下；
|
|
4.
|
維真生物提供質(zhì)粒構(gòu)建、病毒包裝和基因表達(dá)分析等服務(wù)，滿足您不同實驗需求；
|
5.維真生物的四環(huán)素誘導(dǎo)系列載體和Cre on & Flp on系列載體滿足您時空條件性控制目的基因表達(dá)的實驗需求。
我們常說的分子克隆通常包括合成模板、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑菌和重組克隆驗證步驟。下面以從AAV ORF質(zhì)粒構(gòu)建到病毒包裝為例說明，服務(wù)流程示意圖如下：
Step 1：選擇合適的載體
選擇載體的時候，通常要考慮諸多因素，比如細(xì)胞類型，基因大小，基因是否具有特殊性等。維真為您提供各種基因表達(dá)載體以及病毒載體，此外，您也可以自己提供載體。對于某些難感染的細(xì)胞，病毒載體的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于質(zhì)粒載體，而每種病毒穿梭系統(tǒng)都有其各自的特點。
Step 2：選擇合適的啟動子
載體的包裝容量問題，是選擇載體時的關(guān)鍵考慮因素。由于載體包裝容量有限，因此要選擇效果好且大小合適的啟動子，下表列舉一些維真現(xiàn)有的組織特異性啟動子，如果您沒找到想用的啟動子，可以聯(lián)系我們。
|
組織
|
啟動子名稱
|
啟動子
大小
|
啟動子
來源
|
啟動子描述
|
啟動子應(yīng)用
|
|
神經(jīng)
|
hSyn
|
471bp
|
人源
|
突觸蛋白1啟動子
|
神經(jīng)元特異性啟動子
|
|
CamKIIa
|
1.2kb
|
小鼠
|
鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II α啟動子
|
大腦新皮質(zhì)和海馬興奮性神經(jīng)元特異性啟動子
|
|
c-fos
|
1.7kb
|
小鼠
|
c-fos基因啟動子
|
興奮性神經(jīng)元啟動子
|
|
Mecp2
|
230bp
|
小鼠
|
甲基 CpG 結(jié)合蛋白 2啟動子
|
短的神經(jīng)元特異性啟動子
|
|
NSE
|
1.3kb
|
小鼠
|
烯醇化酶啟動子
|
神經(jīng)元特異性啟動子
|
|
Somatostat(SST)
|
1.2kb
|
人源
|
生長抑制素I基因的啟動子
|
gamma氨基丁酸能抑制性神經(jīng)元SST亞型特異性啟動子
|
|
TH
|
2.5kb
|
大鼠
|
酪氨酸羥化酶基因啟動子
|
多巴胺能神經(jīng)元特異性啟動子
|
|
GFAP
|
2.0kb
|
人源
|
膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子
|
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子
|
|
GFAP104
|
845bp
|
人源
|
EF1a和GFAP的嵌合型啟動子
|
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子
|
|
GfaABC1D(truncated GFAP)
|
681bp
|
人源
|
膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子
|
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子
|
|
ALDH1L1
|
1.3kb
|
人源
|
醛脫氫酶1家族成員L1啟動子
|
丘腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子
|
|
MBP
|
1.3kb
|
人源
|
髓磷脂堿性蛋白啟動子
|
少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子
|
|
肝臟
|
ALB
|
2.4kb
|
小鼠
|
白蛋白啟動子
|
肝臟特異性啟動子
|
|
TBG
|
681bp
|
人源
|
甲狀腺素結(jié)合球蛋白啟動子
|
肝臟特異性啟動子
|
|
ApoEHCR-hAAT
|
1.3kb
|
人源
|
載脂蛋白E的肝細(xì)胞控制區(qū)和人α1抗胰蛋白酶啟動子的嵌合啟動子
|
肝臟特異性啟動子
|
|
心臟
|
aMHC
|
0.4kb
|
小鼠
|
肌球蛋白重鏈α啟動子
|
心臟特異性啟動子
|
|
cTNT+intron
|
0.7kb
|
雞
|
心肌肌鈣蛋白T啟動子
|
心肌特異性啟動子
|
|
眼睛
|
Rpe65
|
0.7kb
|
小鼠
|
視網(wǎng)膜色素上皮65啟動子
|
視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性啟動子
|
|
VMD2 promoter
|
0.65bp
|
人源
|
卵黃形成黃斑性營養(yǎng)不良2基因啟動子
|
視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性啟動子
|
|
胰腺
|
Insulin receptor
|
0.85kb
|
小鼠
|
胰島素基因啟動子
|
胰腺β細(xì)胞特異性啟動子
|
|
PDX1
|
2.7kb
|
小鼠
|
胰十二指腸同源盒1啟動子
|
胰腺β細(xì)胞特異性啟動子
|
|
血管
|
SM22a
|
0.45kb
|
小鼠
|
SM22α啟動子
|
血管平滑肌特異性啟動子
|
|
ICAM2
|
0.15kb
|
人源
|
細(xì)胞間粘附分子2啟動子
|
血管內(nèi)皮特異性啟動子
|
|
CD68
|
0.7kb
|
人源
|
CD68分子啟動子
|
單核巨噬細(xì)胞特異性啟動子
|
|
F4/80
|
1.2kb
|
小鼠
|
F4/80基因promoter
|
巨噬細(xì)胞特異性啟動子
|
|
肌肉
|
MCK
|
1.3kb
|
小鼠
|
肌酸激酶基因啟動子
|
肌肉細(xì)胞特異性啟動子
|
|
3×enhancer McK
|
728bp
|
小鼠
|
修改的肌酸激酶基因啟動子
|
肌肉細(xì)胞特異性啟動子
|
|
腎臟
|
NPHS1
|
1.2kb
|
小鼠
|
Nephrin 1基因啟動子
|
腎臟特異性啟動子
|
Step 3：插入ORF片段
維真擁有超過維真擁有超過18000余個人源ORF的現(xiàn)貨克隆庫，可以通過簡單的“剪切粘貼”穿梭到我們的病毒載體中。如果您想從我們的人源ORF庫中選擇，只需提供相應(yīng)的產(chǎn)品編號、基因名稱或基因編號。如果您想定制，我們還提供分子克隆和定點突變服務(wù)。此外，您也可以提供自己的序列，我們將其克隆到相應(yīng)的載體中。
Step 4：選擇合適的標(biāo)簽
維真提供各種標(biāo)簽、報告基因和誘導(dǎo)系統(tǒng)，可用于在 AAV克隆、腺病毒克隆或慢病毒克隆期間自定義我們的病毒載體。
Step 5：病毒包裝
如果您選擇的是病毒載體，后續(xù)有病毒包裝的需求，那么我們可以直接將構(gòu)建好的自定義載體包裝成病毒顆粒。請訪問病毒包裝頁面，了解更多有關(guān)慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒包裝的相關(guān)資料。
1. 如果我不知道序列兩端的酶切位點，也不知道載體的圖譜，但可以提供基因序列和測序引物的序列，你們是否可以承接這個項目？
可以，但是我們在克隆之前需要測序驗證酶切位點附近的序列。
2. 我們能夠提供細(xì)菌培養(yǎng)物作為亞克隆的原材料嗎？
不推薦，因為細(xì)菌培養(yǎng)物不如DNA穩(wěn)定，但是如果細(xì)菌培養(yǎng)物是唯一的選擇，我們也可以嘗試去做。
3. 模板是維真生物之前合成的，你們依然有質(zhì)粒備份嗎，還是需要我們再次提供？
我們通常會保留質(zhì)粒備份1年。如果先前的訂單已完成1年多，但是不超過5年，我們可能還有備份，但是需要跟生產(chǎn)部門核實。
4. 我們有引物，需要我們提供還是你們自己設(shè)計并合成？
我們將自己設(shè)計并合成用于克隆的引物，您只需要提供我們模板，并讓我們知道您最終想得到的基因序列。
5. 我有復(fù)雜的克隆方案，我需要設(shè)計克隆方案嗎？
您只要提供給我們模板序列、模板載體和目的序列、目的載體，我們的生產(chǎn)小組將會設(shè)計最優(yōu)的克隆方案。
