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雙熒光素酶報告基因檢測服務

熒光素酶（luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在氧化過程中發(fā)出生物熒光。熒光素酶以出色的靈敏度、使用方便、可定量檢測成為理想的報告基因。熒光素酶的種類很多，其中應用較為廣泛的是螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase，F(xiàn)LUC）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，RLUC）。

雙熒光素酶催化發(fā)光原理

■ 螢火蟲熒光素酶是一個61kD的單體酶，不需要表達后修飾即可獲得酶活性，其催化的發(fā)光反應必須要有ATP和熒光素的參與，在ATP、Mg²⁺和O₂存在的條件下，熒光素在熒光素酶的催化下氧化產(chǎn)生黃綠光，波長540-600nm。

■ 海腎熒光素酶是一個36kD的單體酶，同樣不需要表達后修飾即可產(chǎn)生酶活性，只需要O₂即可催化腔腸素氧化發(fā)出藍光，波長460-540nm。

雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)

由于螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的催化底物和發(fā)光顏色不同，且光吸收波長不同，可在互不干擾的情況下進行檢測，此外，在哺乳動物體內(nèi)兩種酶均無內(nèi)源性表達，因此作為雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)得到廣泛使用。在雙熒光素酶檢測中，通常以螢火蟲熒光素酶為實驗報告基因，以海腎熒光素酶為對照報告基因，以減少細胞活性、轉(zhuǎn)染效率等外在變化因素對實驗準確性的影響。

1、檢測方法

將螢火蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒與帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，或者將兩種報告基因構建到同一載體上，用不同的啟動子啟動其表達，通過計算螢火蟲熒光素酶檢測值與海腎熒光素酶檢測值的比值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），分析熒光素酶的表達水平。

2、應用場景

雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)憑借靈敏度高、檢測范圍廣、方便快速的優(yōu)勢，已成為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、啟動子結構分析、啟動子SNP分析和非編碼RNA靶向互作等研究的重要手段。

★維真生物雙熒光素酶檢測服務★

服務內(nèi)容一：啟動子與轉(zhuǎn)錄因子互作檢測

將靶啟動子片段插入到螢火蟲熒光素酶表達序列上游，構建實驗報告基因質(zhì)粒，將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與兩種報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染相關細胞；經(jīng)細胞培養(yǎng)后裂解細胞，離心取上清，隨后分別加入兩種熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強度測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否與該啟動子存在相互作用。

備注：如果轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則螢火蟲熒光素酶基因就會表達，且螢火蟲熒光素酶的表達水平與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。

啟動子與轉(zhuǎn)錄因子互作檢測示意圖

相關載體：

服務內(nèi)容二：miRNA-靶基因調(diào)控驗證

miRNA通過識別mRNA的3’UTR區(qū)，誘導細胞內(nèi)沉默復合體介導的mRNA降解或抑制mRNA的翻譯過程。將野生型或突變型待測靶基因的3’UTR序列構建至螢火蟲熒光素酶基因的3’端，將兩個報告基因質(zhì)粒與miRNA在細胞內(nèi)共表達，通過比較螢火蟲熒光素酶報告基因表達活性的改變，驗證miRNA對靶基因的調(diào)控作用。

備注：若螢光素酶的活性降低，提示miRNA可能參與抑制靶基因的表達。

miRNA與靶基因調(diào)控驗證示意圖

相關載體：

服務流程：

啟動子與轉(zhuǎn)錄因子互作檢測

miRNA與靶基因調(diào)控驗證