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南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院姚勇/魏婷婷團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)TGR5可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變治療新靶點(diǎn)！

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是一種嚴(yán)重且相對(duì)未被認(rèn)識(shí)到的糖尿病并發(fā)癥，Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞遍及視網(wǎng)膜，在維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。先前研究表明，膽汁酸激活GPCR家族成員TGR5可以改善DR，但TGR5在調(diào)節(jié) Müller細(xì)胞功能中的作用及其機(jī)制尚不清楚。2023年9月1日，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院姚勇和魏婷婷團(tuán)隊(duì)在Cell Death and Disease（IF 9.0）上發(fā)表論文“TGR5 supresses cGAS/STING pathway by inhibiting GRP75-mediated endoplasmic reticulum-mitochondrial coupling in diabetic retinopathy”，研究發(fā)現(xiàn)TGR5是維持線粒體功能的關(guān)鍵因素，TGR5激動(dòng)劑可預(yù)防視網(wǎng)膜損傷，而TGR5敲低可加重DR大鼠視網(wǎng)膜損傷，表明TGR5可能是治療DR的新靶點(diǎn)。

01 研究結(jié)果

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（Müller glial cells）遍布視網(wǎng)膜，發(fā)揮維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)和完整性的功能。免疫熒光染色結(jié)果提示TGR5在Müller細(xì)胞中表達(dá)，TGR5激動(dòng)劑INT-777顯著地挽救了高糖（HG）誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降。Müller細(xì)胞線粒體形態(tài)研究發(fā)現(xiàn)HG處理的細(xì)胞中線粒體分裂成短球體，INT-777顯著恢復(fù)線粒體形態(tài)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TGR5可能通過PKCδ-Drp1途徑調(diào)節(jié)線粒體裂變。此外，INT-777上調(diào)線粒體呼吸鏈復(fù)合物如NDUFB8、SDHB、UQCRC2、MTCO1和ATP5A1的表達(dá)，且明顯減輕隨HG刺激而降低的MMP，表明TGR5激活改善了線粒體功能。通過轉(zhuǎn)染TGR5特異性siRNA，發(fā)現(xiàn)TGR5的下調(diào)加重了HG誘導(dǎo)的線粒體斷裂；同時(shí)，TGR5的下調(diào)導(dǎo)致MMP的降低。以上結(jié)果表明TGR5是介導(dǎo)線粒體功能的關(guān)鍵因素。

2、TGR5通過調(diào)節(jié)MAMs影響線粒體Ca²⁺穩(wěn)態(tài)

作者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TGR5通過調(diào)節(jié)線粒體Ca²⁺水平來調(diào)節(jié)線粒體功能，MAMs介導(dǎo)Ca²⁺從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體的外排。HG處理的細(xì)胞中，MAM的形成增加，在INT-777處理后，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的共定位顯著減少。因此，作者推測(cè)TGR5介導(dǎo)的線粒體Ca²⁺穩(wěn)態(tài)是由MAMs調(diào)節(jié)的。IP3R1-GRP75-VDAC1軸被證明存在于MAMs中，負(fù)責(zé)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到線粒體的Ca²⁺運(yùn)輸。GRP75在HG條件下顯著上調(diào)，而TGR5的激活逆轉(zhuǎn)了其升高。免疫共沉淀和免疫熒光顯示HG培養(yǎng)增加了GRP75與VDAC1以及GRP75與IP3R1的結(jié)合，而INT-777處理可以抑制這些結(jié)合。與HG組相比，TGR5敲低促進(jìn)了MAM的形成并降低了線粒體Ca²⁺水平。然而，TGR5沉默對(duì)MAM形成和線粒體Ca²⁺過載的影響被GRP75沉默顯著逆轉(zhuǎn)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，TGR5抑制GRP75的表達(dá)導(dǎo)致IP3R1-GRP75-VDAC1復(fù)合物的形成受阻，從而降低線粒體Ca²⁺水平。

3、TGR5激活可阻斷cGAS-STING介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕DR大鼠視網(wǎng)膜損傷

作者進(jìn)一步探究TGR5對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)和cGAS-STING通路的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)TGR5激活可以維持線粒體穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而抑制cGAS-STING介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。為進(jìn)一步闡明TGR5在DR中的作用，作者利用STZ誘導(dǎo)的DR大鼠進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。DR大鼠VEGF表達(dá)升高，而INT-777抑制其異常升高；同時(shí)，INT-777抑制DR大鼠的8-OHdG的上調(diào)，說明視網(wǎng)膜DNA損傷得到一定程度的修復(fù)。作者還觀察到DR大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)的異常，這種現(xiàn)象被INT-777改善。此外，WB分析顯示，INT-777顯著降低視網(wǎng)膜炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-β的表達(dá)。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，DR大鼠視網(wǎng)膜中GRP75上調(diào)，cGAS-STING信號(hào)被激活，INT-777下調(diào)GRP75、cGAS和p-STING信號(hào)。綜上所述，TGR5激活阻斷了cGAS-STING介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕了DR大鼠視網(wǎng)膜損傷。

4、STING抑制劑可改善AAV-shTGR5誘導(dǎo)的DR大鼠視網(wǎng)膜功能障礙加重

接下來，作者探討了TGR5與cGAS-STING之間的關(guān)系，利用AAV-shTGR5敲低DR大鼠視網(wǎng)膜TGR5，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AAV-shTGR5顯著沉默TGR5表達(dá)。與對(duì)照組相比，AAV-shTGR5組視網(wǎng)膜外核層(ONL)和內(nèi)核層(INL)變薄，給藥H-151可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。在AAV-shTGR5組中，cleaved caspase-3顯著上調(diào)，而H-151處理顯著減少了視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。STZ處理導(dǎo)致VEGF表達(dá)升高，AAV-shTGR5進(jìn)一步強(qiáng)化VEGF表達(dá)，H-151逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)。電鏡顯示糖尿病視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜較對(duì)照組明顯增厚，AAV-shTGR5進(jìn)一步加重了基底膜增厚。TGR5可能通過負(fù)調(diào)控cGAS-STING信號(hào)通路來影響Müller細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。