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『CircRNA領(lǐng)域新發(fā)現(xiàn)』浙江大學(xué)范順武教授課題組發(fā)現(xiàn)CircRNA :CircSERPINE2,為骨關(guān)節(jié)炎治療提供有效策略

環(huán)狀RNA（circular RNAs，CircRNAs）是一類特殊的非編碼RNA分子，不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，具有組織特異性和高度保守性，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。與線性RNA相比，CircRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。一些CircRNAs富含miRNA結(jié)合位點(diǎn)，在細(xì)胞中可以作為miRNA海綿（miRNA sponge）或競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），自動(dòng)隔離或競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA的活性，進(jìn)而解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，提高靶基因的表達(dá)水平。最近不斷發(fā)現(xiàn)circRNA在不同研究領(lǐng)域和研究方向的新功能，circRNA已成為RNA研究領(lǐng)域的最新熱點(diǎn)，吸引著無(wú)數(shù)科研工作者的目光。

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種由增齡、肥胖、勞損、創(chuàng)傷等諸多因素引起的退行性病變，主要特征是軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生，臨床表現(xiàn)為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等，多發(fā)于中老年人?？茖W(xué)家研究發(fā)現(xiàn)CircRNA表達(dá)水平的改變與OA發(fā)生有關(guān)，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院范順武教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)在對(duì)OA研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的CircRNA，（hsa_circ_0008365，命名為CircSERPINE2），CircSERPINE2過表達(dá)通過miR-1271 - ERG通路緩解軟骨細(xì)胞（HCs）凋亡及促進(jìn)胞外基質(zhì)（ECM）的合成代謝，在OA治療中可發(fā)揮積極作用。

研究結(jié)果

1.CircRNA在正常人體及OA患者組織中的表達(dá)

臨床OA患者和正常人體組織進(jìn)行RNAseq分析，發(fā)現(xiàn)OA組CircRNA表達(dá)呈現(xiàn)差異。RT-qPCR分析確定了25個(gè)表達(dá)差異最大的CircRNA及14個(gè)下調(diào)的CircRNA。作者用白細(xì)胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α處理的的原發(fā)性人類軟骨細(xì)胞(HCs)試驗(yàn)證實(shí)了包含hsa_circ_0008365在內(nèi)的六種CircRNA在OA樣本組織中表達(dá)下調(diào)。Sanger測(cè)序法確定hsa_circ_0008365是由Serpine2基因的第二個(gè)至第四個(gè)外顯子環(huán)化組成，即5’端剪接位點(diǎn)和外顯子3’端相應(yīng)位點(diǎn)形成的頭尾剪接，因此命名為CircSERPINE2。

OA患者和正常人體軟骨細(xì)胞中CircSERPINE2的表達(dá)水平檢測(cè)顯示，CircSERPINE2在OA樣本呈表達(dá)下調(diào)模式，在HCs的細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)（圖1）。

圖1 CircSERPINE2在OA軟骨組織和細(xì)胞中的驗(yàn)證和表達(dá)

2.CircSERPINE2調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡和ECM代謝

為了評(píng)估CircSERPINE2參與了基質(zhì)降解酶的調(diào)控，作者用CircSERPINE2小干擾RNA轉(zhuǎn)染HCs，發(fā)現(xiàn)CircSERPINE2表達(dá)下調(diào)并不影響SERPINE2的mRNA水平，而是增加HCs的凋亡率，CircSERPINE2的過表達(dá)可明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的HCs凋亡率。WB結(jié)果顯示抑制CircSERPINE2的表達(dá)增加了MMP3、MMP13和ADAMTS4（基質(zhì)降解相關(guān)酶）的表達(dá)，降低SOX9、COL2A1和aggrecan的表達(dá)。IF和RT-qPCR結(jié)果再次證實(shí)，CircSERPINE2表達(dá)的下調(diào)顯著影響了HCs和SW1353細(xì)胞（人骨肉瘤細(xì)胞）中MMP13、ADAMTS4、COL2A1和aggrecan的表達(dá)水平，CircSERPINE2的下調(diào)促進(jìn)了HCs和SW1353細(xì)胞凋亡和代謝過程（圖2）。

圖2 CircSERPINE2表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解酶的表達(dá)

3.CircSERPINE2是miRNAs的吸附海綿

研究發(fā)現(xiàn)OA組織中有191個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，CircSERPINE2可下調(diào)miR-1271和miR-93的表達(dá)。WB結(jié)果顯示miR-1271與基質(zhì)降解和合成蛋白的表達(dá)有關(guān)，而miR-1271在10個(gè)OA樣本軟骨中表達(dá)上調(diào)。熒光素酶檢測(cè)和FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)CircSERPINE2與miR-1271結(jié)合。miR-1271過表達(dá)的細(xì)胞凋亡率升高，伴隨MMP3、MMP13和ADAMTS4表達(dá)的增強(qiáng)，SOX9、COL2A1和aggrecan表達(dá)的降低。抑制miR-1271的表達(dá)時(shí)，基質(zhì)降解和合成相關(guān)蛋白的表達(dá)水平則與此相反（圖3）。

圖3 CircSERPINE2作為miR-1271的海綿在HC細(xì)胞發(fā)揮作用

4.CircSERPINE2通過靶向miR-1271的表達(dá)在OA中發(fā)揮作用

將sh-CircSERPINE2和miR-1271海綿腺病毒共感染細(xì)胞。已知下調(diào)CircSERPINE2的表達(dá)可增加HC的凋亡率，而抑制miR-1271和CircSERPINE2的表達(dá)可顯著挽救HC的凋亡率。與單獨(dú)感染sh-CircSERPINE2和miR-1271海綿腺病毒的細(xì)胞相比，共感染sh-CircSERPINE2和miR-1271海綿腺病毒的細(xì)胞中，MMP13、MMP3和ADAMTS4的蛋白和mRNA水平顯著降低，SOX9、COL2A1和aggrecan的蛋白和mRNA水平則顯著提高。IF結(jié)果顯示與用CircSERPINE2抑制劑處理過的細(xì)胞相比，CircSERPINE2和miR-1271表達(dá)抑制劑處理的細(xì)胞中，COL2A1和aggrecan表達(dá)水平升高，而MMP13和ADAMTS4表達(dá)水平降低，表明CircSERPINE2在體外通過靶向miR-1271發(fā)揮作用（圖4）。

圖4 miR-1271表達(dá)下調(diào)逆轉(zhuǎn)HC細(xì)胞CircSERPINE2誘導(dǎo)的軟骨降解

5.miR-1271直接作用于ETS相關(guān)基因

miR-1271和CircSERPINE2作用靶點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)E26轉(zhuǎn)化特異性相關(guān)基因（ERG）對(duì)COL2A1、aggrecan、MMP3和MMP13表達(dá)水平的影響最為明顯，在OA受損軟骨區(qū)域顯著下調(diào)。ERG是miR-1271的一個(gè)預(yù)測(cè)靶標(biāo)，熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-1271 mimic明顯抑制轉(zhuǎn)染W(wǎng)T ERG 3 ' -UTR細(xì)胞的熒光素酶活性，降低ERG的蛋白和mRNA表達(dá)水平，而miR-1271 inhibitor則顯示出相反的作用。ERG過表達(dá)降低MMP3、MMP13和ADAMTS4的表達(dá)，提高SOX9和COL2A1的表達(dá)，表明miR-1271確實(shí)靶向ERG，內(nèi)源性ERG表達(dá)與OA發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

Pre-miR-1271腺病毒感染抑制ERG的表達(dá)，明顯降低HCs中COL2A1、SOX9和aggrecan的表達(dá)，增加MMP3、MMP13和ADAMTS4的表達(dá)，ERG過表達(dá)后這些作用被消除。表明miR-1271過表達(dá)通過調(diào)節(jié)ERG損害軟骨表型（圖5）。

圖5 ERG是miR-1271的直接靶點(diǎn)，介導(dǎo)miR-1271在HC細(xì)胞中的功能

6.注射CircSERPINE2可緩解OA兔的癥狀

為了確定CircSERPINE2是否在體內(nèi)OA的進(jìn)展中發(fā)揮作用，作者將WT或MUT腺相關(guān)病毒(AAV) CircSERPINE2（由維真生物構(gòu)建和包裝）通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射入前交叉韌帶橫切(ACLT)誘導(dǎo)的OA兔體內(nèi)。結(jié)果顯示OA兔在注射WT AAV CircSERPINE2后軟骨表面得到了改善，而注射MUT AAV CircSERPINE2則無(wú)改善。國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì)(OARSI)評(píng)分顯示，WT AAV CircSERPINE2顯著降低了OARSI評(píng)分，而MUT AAV CircSERPINE2則提高了OARSI評(píng)分。顯微CT圖像顯示OA兔骨贅增加，而關(guān)節(jié)內(nèi)注射CircSERPINE2的OA兔骨贅減少。免疫組化和WB結(jié)果顯示，注射WT AAV CircSERPINE2減輕兔OA模型軟骨基質(zhì)的退行性變化，如細(xì)胞凋亡增強(qiáng)和分解代謝反應(yīng)增強(qiáng)，ECM組成增加。綜上所述，CircSERPINE2的升高在抑制ECM分解代謝、促進(jìn)合成代謝和減輕體內(nèi)OA方面具有積極作用（圖6）。

圖6 CircSERPINE2減輕OA兔癥狀

小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)circRNA：CircSERPINE2 通過SERPINE2基因第2個(gè)至第4個(gè)外顯子反向拼接產(chǎn)生，其序列在人與兔之間較為保守，是一個(gè)參與OA的關(guān)鍵下調(diào)circRNA；CircSERPINE2含有保守的miR-1271靶點(diǎn)，miR-1271在OA中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與SOX9、aggrecan和COL2A1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)， CircSERPINE2通過靶向miR-1271-ERG途徑抑制HCs凋亡，促進(jìn)ECM合成并抑制ECM分解代謝，發(fā)揮抗OA作用。CircSERPINE2-miR-1271-ERG軸將成為預(yù)防和治療OA的新靶點(diǎn)。