案例分享 ‖ 腺病毒在自噬研究中的應(yīng)用
案例分享‖腺病毒在自噬研究中的應(yīng)用
線粒體自噬
線粒體是細(xì)胞ATP產(chǎn)生，三羧酸循環(huán)，脂類，鐵硫簇，血紅素合成的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的主要來(lái)源。線粒體功能與細(xì)胞的生存與代謝密切相關(guān)，線粒體參與了自噬，凋亡，細(xì)胞分裂，信號(hào)傳遞等幾乎所有的生化過(guò)程。線粒體功能的紊亂可以導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，如費(fèi)氏共濟(jì)失調(diào)，阿爾茨海默癥，帕金森病，糖尿病，Leber視神經(jīng)病等。
在ROS、營(yíng)養(yǎng)缺乏、細(xì)胞衰老等外界刺激的作用下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體發(fā)生去極化出現(xiàn)損傷。損傷的線粒體被特異性的包裹進(jìn)自噬體中并與溶酶體融合，從而完成線粒體的降解，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，這個(gè)過(guò)程被稱為線粒體自噬。
線粒體自噬是由PINK1 - Parkin介導(dǎo)的選擇性清除多余或受損線粒體的自噬過(guò)程。正常條件下，PTEN誘導(dǎo)激酶1 (PINK1)通過(guò)線粒體靶向序列連續(xù)靶向線粒體，并被基質(zhì)處理肽酶MPP降解，隨后被線粒體內(nèi)膜中的蛋白酶PARL切割，裂解的PINK轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿，并被蛋白酶體降解。當(dāng)線粒體受損時(shí)，PINK1通過(guò)外膜轉(zhuǎn)位酶（TOM）在線粒體外膜積累，激活并招募Parkin，隨后線粒體外膜上的蛋白VDAC1和Mfn1/2被Parkin泛素化，誘導(dǎo)線粒體自噬。泛素化后，包括p62在內(nèi)的受體蛋白在線粒體外膜中積累，導(dǎo)致泛素化的貨物通過(guò)與LC3結(jié)合被招募到自噬體中，成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，包含的線粒體隨后被降解。
圖1：線粒體自噬的分子機(jī)制（Guan, R., et al. J Biomed Sci, 2018）
文章中涉及的熒光指示體系
mCherry-EGFP-LC3B雙熒光指示體系：GFP熒光蛋白是酸敏感型蛋白，而mCherry是穩(wěn)定的熒光表達(dá)基團(tuán)。自噬形成時(shí)，mCherry-GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)移至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的黃色熒光斑點(diǎn)。當(dāng)自噬溶酶體形成后，酸性的溶酶體環(huán)境使GFP熒光淬滅，mCherry熒光不受影響，自噬溶酶體呈現(xiàn)紅色熒光。因此，通過(guò)mCherry-EGFP-LC3B雙熒光指示體系可以非常有效地追蹤自噬過(guò)程。
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mt-Keima：Keima蛋白定位于線粒體，具有在酸性和中性pH中熒光信號(hào)不同的特性，可以直觀地反映線粒體自噬程度。
MitoTracker：用于對(duì)活細(xì)胞線粒體進(jìn)行染色。
LysoTracker：用于標(biāo)記和跟蹤活細(xì)胞中的溶酶體。
DQ-BSA染料：一種被熒光染料標(biāo)記的自淬的蛋白質(zhì)，一旦進(jìn)入溶酶體，DQ-BSA就會(huì)被溶酶體蛋白酶裂解，導(dǎo)致熒光片段的不淬滅和釋放，發(fā)出明亮的熒光。因此，DQ-BSA可用來(lái)指示溶酶體的功能是否正常。
圖2：DQ-BSA原理示意圖（Marwaha, R., et al . J Cell Biol, 2017. ）
研究背景
術(shù)后認(rèn)知功能障礙(Post operative cognitive dysfunction，POCD)是老年人手術(shù)后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，表現(xiàn)為術(shù)后記憶力和集中力下降、精神錯(cuò)亂、焦慮等。高齡是發(fā)生POCD的主要危險(xiǎn)因素之一，越來(lái)越多的證據(jù)表明麻醉會(huì)引起POCD老年患者的神經(jīng)毒性和神經(jīng)認(rèn)知能力下降。對(duì)POCD老年大鼠模型的研究表明，七氟醚（Sevoflurane，一種麻醉藥物）可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶缺失；此外，線粒體自噬功能障礙也被認(rèn)為與POCD相關(guān)。作者先前的研究已表明，自噬功能障礙與七氟醚誘導(dǎo)的老年大鼠POCD有關(guān)。然而，尚不清楚線粒體自噬受損是否與老年大鼠POCD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。
研究結(jié)果
01 七氟醚可誘導(dǎo)體內(nèi)外線粒體損傷
使用七氟醚處理H4細(xì)胞，線粒體中的ROS水平大幅升高，并且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，同時(shí)膜電位下降，細(xì)胞質(zhì)鈣水平升高，線粒體呼吸功能受抑，表明七氟醚破壞了H4細(xì)胞的線粒體平衡；使用七氟醚處理老年大鼠，發(fā)現(xiàn)線粒體變小，Tomm20（線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶）的表達(dá)水平顯著升高，海馬區(qū)LAMP1（溶酶體相關(guān)膜蛋白1）的表達(dá)水平降低，此外線粒體分裂蛋白Fis1表達(dá)增加，融合蛋白OPA1和 Mfn2表達(dá)降低，表明七氟醚引起了老年大鼠的線粒體損傷并影響了溶酶體的功能（見原文圖1，圖2）。
02 七氟醚可誘導(dǎo)體內(nèi)外線粒體自噬功能受損
為探討七氟醚是否會(huì)影響線粒體自噬過(guò)程，將AdM-CMV-mCherry-EGFP-LC3B轉(zhuǎn)染H4細(xì)胞，免疫熒光定量表明，SEV組GFP的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照組，但RFP的熒光強(qiáng)度沒有差異（表明自噬過(guò)程受阻）。使用mt-Keima測(cè)量線粒體自噬通量，加入線粒體自噬誘導(dǎo)劑CCCP時(shí)，H4細(xì)胞的紅色熒光增強(qiáng)，表明線粒體自噬被誘導(dǎo)。SEV組與對(duì)照組相比具有較低的紅色熒光，這說(shuō)明七氟醚抑制了H4細(xì)胞線粒體自噬功能。MitoTracker（紅色熒光指示）和LysoTracker（綠色熒光指示）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，七氟醚處理后H4細(xì)胞中線粒體數(shù)量增加，而溶酶體數(shù)量未發(fā)生變化。此外，H4細(xì)胞中DQ-BSA熒光強(qiáng)度顯著降低，表明溶酶體功能受損。WB法檢測(cè)原代培養(yǎng)神經(jīng)元 LC3B、p62和Tomm20的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與Ctrl組相比， SEV組的三種蛋白表達(dá)水平均較高。（圖3）。
圖3：七氟醚誘導(dǎo)體外線粒體自噬功能受損
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)老年大鼠海馬中SEV-6h組LC3BII/I、p62和Tomm20三種蛋白的表達(dá)同樣上調(diào)，并且七氟醚處理后老齡大鼠海馬區(qū)cathepsin B（溶酶體組織蛋白酶B，參與自噬降解 ）表達(dá)水平顯著降低，而且成熟形式的cathepsin B幾乎消失（圖4）。
圖4：七氟醚誘導(dǎo)體內(nèi)線粒體自噬功能受損
結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果：七氟醚可誘導(dǎo)體內(nèi)外溶酶體功能及線粒體自噬功能受損，阻斷自噬溶酶體的形成。
03 雷帕霉素可逆轉(zhuǎn)七氟醚誘導(dǎo)的線粒體損傷及自噬功能障礙
H4細(xì)胞中自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素的加入顯著降低了七氟醚引起的胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS水平的升高，并改善了老年大鼠海馬線粒體的形態(tài)。熒光成像和定量數(shù)據(jù)表明，經(jīng)雷帕霉素處理后，SEV組LAMP1的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，Tomm20的熒光強(qiáng)度降低，表明雷帕霉素改善了七氟醚引起的溶酶體及線粒體功能的受損。
雷帕霉素處理后，SEV組GFP的熒光強(qiáng)度明顯降低，說(shuō)明雷帕霉素恢復(fù)了自噬通量。經(jīng)WB檢測(cè)，雷帕霉素處理后原代培養(yǎng)神經(jīng)元和大鼠海馬中自噬標(biāo)記物p62、Tomm20表達(dá)水平均降低。上述體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明雷帕霉素逆轉(zhuǎn)了七氟醚誘導(dǎo)的線粒體自噬功能障礙（圖5）。
圖5：雷帕霉素逆轉(zhuǎn)了七氟醚誘導(dǎo)的線粒體自噬功能障礙
04 雷帕霉素可改善老年大鼠的認(rèn)知功能缺陷
行為學(xué)試驗(yàn)（莫里斯水迷宮）和對(duì)海馬錐體神經(jīng)元和神經(jīng)元樹突的染色觀察實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)老年大鼠的認(rèn)知功能障礙是由海馬錐體神經(jīng)元中樹突棘數(shù)目的減少導(dǎo)致的，雷帕霉素可減輕海馬神經(jīng)元中樹突棘數(shù)量的減少，改善大鼠認(rèn)知缺陷。（見原文圖7）。
05 七氟醚通過(guò)抑制Parkin的表達(dá)而引起線粒體自噬功能障礙
最后，為了闡明七氟醚誘導(dǎo)線粒體自噬功能障礙的可能機(jī)制，作者對(duì)Cox4l1（細(xì)胞色素氧化酶）和Parkin蛋白在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的積累進(jìn)行了檢測(cè)。WB結(jié)果表明，mito-SEV組Parkin蛋白表達(dá)量低于mito-Ctrl組。將EGFP-PARK2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H4細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)ROS水平降低，并且線粒體自噬增強(qiáng)，同時(shí)由七氟醚引起的的線粒體自噬功能障礙得到緩解。這些結(jié)果表明，七氟醚通過(guò)抑制PARK2的表達(dá)影響線粒體正常自噬功能（圖6）。
圖6：七氟醚通過(guò)抑制Parkin的表達(dá)影響線粒體自噬功能
小結(jié)
作者結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，在多方面證實(shí)了七氟醚可誘導(dǎo)體內(nèi)外線粒體損傷及溶酶體功能受損，阻斷線粒體自噬過(guò)程中自噬溶酶體的形成，影響線粒體的正常自噬功能；自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素可改善七氟醚引起的線粒體損傷及線粒體自噬功能受阻及老年大鼠認(rèn)知障礙。本研究闡述了線粒體自噬功能障礙可能是七氟醚誘導(dǎo)的術(shù)后認(rèn)識(shí)障礙的機(jī)制，為術(shù)后認(rèn)知障礙的治療提供了一種新的策略。
維真生物腺病毒相關(guān)產(chǎn)品及服務(wù)
現(xiàn)貨產(chǎn)品
維真生物擁有兩大人源基因腺病毒現(xiàn)貨庫(kù)——12000個(gè)ORF腺病毒和1200余個(gè)miRNA腺病毒。此外，還有幾十余種常備腺病毒現(xiàn)貨，覆蓋熒光蛋白、Cre重組酶、LacZ和細(xì)胞自噬等功能基因。
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? 腺病毒均已純化，滴度高，可直接用于體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)；
? 具有競(jìng)爭(zhēng)力的價(jià)格；
? 感染效率高，是難感染細(xì)胞的理想選擇；
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? 交貨時(shí)間短，3-4周即可發(fā)貨；
? 承諾在HEK293細(xì)胞中蛋白表達(dá)；（無(wú)效退款）
技術(shù)服務(wù)
維真生物擁有豐富的腺病毒包裝經(jīng)驗(yàn)，可為客戶提供體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)所需的各種規(guī)格腺病毒，以滿足客戶多樣化的實(shí)驗(yàn)需求。
? 載體全：多種表達(dá)載體、多種標(biāo)簽載體和多種報(bào)告基因可供客戶選擇。
? 貨期短：Human ORF cDNA克隆可在2-3天穿梭至其他標(biāo)簽（3×Flag，Myc，F(xiàn)lag，HA，6×His，F(xiàn)lag & His，GFP，RFP等）的穿梭載體，個(gè)性化定做腺病毒；
? 純度高：采用改良的碘克砂醇密度梯度超速離心法進(jìn)行腺病毒純化，對(duì)于動(dòng)物沒有任何毒性；
? 服務(wù)優(yōu)：可根據(jù)客戶具體實(shí)驗(yàn)，由公司專業(yè)技術(shù)人員提供載體構(gòu)建方案，提供特殊定制服務(wù)。
參考文獻(xiàn)
[1]. Yoo, S.M. and Y.K. Jung, A Molecular Approach to Mitophagy and Mitochondrial Dynamics. Mol Cells, 2018. 41(1): p. 18-26.
[2]. Guan, R., et al., Mitophagy, a potential therapeutic target for stroke. J Biomed Sci, 2018. 25(1): p. 87.
[3]. Marwaha, R., et al., The Rab7 effector PLEKHM1 binds Arl8b to promote cargo traffic to lysosomes. J Cell Biol, 2017. 216(4): p. 1051-1070.
