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2020諾獎(jiǎng)出爐 ‖ 再次了解CRISPR/Cas9這個(gè)黑科技

CRISPR/Cas9系統(tǒng)

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CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR主要有兩類:第1類(包括第I、III、IV型)利用多種Cas蛋白，而第2類(第II、V、VI型)則需要單一Cas蛋白。這些Cas蛋白利用RNA引導(dǎo)靶向切斷并降解外來入侵DNA。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常用的用于基因編輯的Cas酶包括II型化膿性鏈球菌(Sp)Cas9、略小的金黃色葡萄球菌(Sa) Cas9或V型Cas12a / Cpf1。在II型CRISPR系統(tǒng)中，crRNA與反式激活tracrRNA形成復(fù)合物(稱向?qū)NA，gRNA)，靶向Cas9蛋白從而切斷DNA中的特定位點(diǎn)。

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯應(yīng)用中，gRNA中包含了一個(gè)與基因組DNA靶點(diǎn)互補(bǔ)(附近有一個(gè)前間區(qū)序列鄰近基序，簡稱PAM)的20 bp序列，它將Cas9蛋白定位到該位點(diǎn)，從而在DNA中產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)。Cas9蛋白切割后產(chǎn)生的DSB主要通過兩種機(jī)制進(jìn)行修復(fù)：一種是細(xì)胞內(nèi)源性的非同源端連接修復(fù)機(jī)制(NHEJ)，可以導(dǎo)致小的插入或刪除(indels)，或通過同源定向修復(fù)(HDR)，添加外源性模板，產(chǎn)生新的DNA。（圖一）

圖1.CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)

1. spCas9 和 saCas9

根據(jù)PAM序列的不同，Cas9分為spCas9和saCas9兩種。（圖二）

saCas9基因序列長約3.3kb，spCas9基因序列長約4.1kb，由于saCas9的基因序列要比spCas9的基因序列短很多，所以在克隆方面，saCas9要更為容易，且saCas9更適宜包裝成AAV病毒，兩者也都可以包裝成腺病毒和慢病毒。saCas9和spCas9另外一個(gè)很大的區(qū)別是兩者識(shí)別的PAM序列不同，saCas9識(shí)別的PAM序列是5’-NNGRRT-3’,而spCas9識(shí)別的PAM序列為5’-NGG-3’,因?yàn)閟aCas9的PAM序列要比spCas9的PAM序列長，在基因組中出現(xiàn)的概率更低，相比于spCas9脫靶率要低，其gRNA設(shè)計(jì)也相對(duì)更困難。

圖2.spCas9和saCas9

2. CRISPR/Cas9與ZFN和TALENs的比較

CRISPR/Cas9是繼ZFN和TALENs之后的第三代基因編輯技術(shù)。與前兩代基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9具有低成本、高效率和簡單易用等優(yōu)勢(shì)，因而被人們廣泛應(yīng)用。下表所列為ZFN、TALENs和CRISPR/Cas9三種基因編輯技術(shù)的比較。

特性	ZFN	TALENs	CRISPR/ Cas9
序列識(shí)別組分	蛋白-DNA	蛋白-DNA	RNA-DNA
靶向效率	特異性和效率低	特異性和效率較低	特異性和效率高
成本效率	成本高	成本較高	成本低
脫靶誘變	可變的	低	中等的
設(shè)計(jì)參數(shù)	蛋白	蛋白	RNA
病毒傳遞	容易	中等	中等

3. CRISPR /Cas9技術(shù)的應(yīng)用

①基因功能篩選

利用慢病毒載體中建立單一的gRNA文庫并應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因功能分析，與現(xiàn)有的RNA干擾文庫比較，除了產(chǎn)生敲除而不是暫時(shí)敲除外，也降低了脫靶效應(yīng)。 ②為診斷和基因治療創(chuàng)建細(xì)胞和動(dòng)物模型

CRISPR/Cas9技術(shù)可精確地修改細(xì)胞和動(dòng)物模型中的DNA，可能從單點(diǎn)突變到染色體易位，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和動(dòng)物系統(tǒng)的產(chǎn)生。這一應(yīng)用不僅對(duì)診斷有效，而且對(duì)錯(cuò)誤插入或缺失的糾正也有效，從而成為基因治療的一個(gè)重要方面。

③抗菌及抗病毒藥物應(yīng)用

研究表明，通過噬菌體傳遞針對(duì)細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，有助于靶向耐藥候選菌。類似地，序列特異性抗病毒藥物也在開發(fā)中，可利用CRISPR/ Cas9技術(shù)修飾參與宿主-病毒相互作用的基因。

④在植物中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)為植物基礎(chǔ)研究提供了寶貴的工具，也為作物改良提供了機(jī)會(huì)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以很容易地對(duì)普通作物進(jìn)行改造，有望成為植物育種的發(fā)展方向。水稻、小麥、玉米、番茄、蘋果、模范豆科植物、荷花、苜蓿等均已成功轉(zhuǎn)化。

維真CRISPR/Cas9特色產(chǎn)品

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①gRNA現(xiàn)貨質(zhì)粒 ? 13000余個(gè)小鼠gRNA pool克隆和350余個(gè)人源gRNA pool克??； ? 針對(duì)每個(gè)基因設(shè)計(jì)多條gRNAs，敲除概率大； ? 人源gRNA pool克隆均經(jīng)過敲除效果驗(yàn)證，效果有保障； ? 交貨時(shí)間短，次日發(fā)貨； ? 現(xiàn)貨供應(yīng)。

小鼠和人源gRNA克隆所用質(zhì)粒

②敲除細(xì)胞系

?160余種人源基因HEK293敲除細(xì)胞系；

?人源基因HEK293敲除細(xì)胞系比瞬時(shí)敲除效率更高，時(shí)間更長，效果更好；

?交貨時(shí)間短，敲除細(xì)胞系2周發(fā)貨；

維真CRISPR/Cas9特色服務(wù)

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維真生物可為科研工作者提供全套CRISPR/Cas9相關(guān)服務(wù)，包括gRNA的設(shè)計(jì)與篩選、gRNA/Cas9載體構(gòu)建、gRNA/Cas9病毒包裝、敲除效果驗(yàn)證以及KO細(xì)胞系的建立。

1. 服務(wù)項(xiàng)目全：維真生物可以提供從gRNA序列設(shè)計(jì)、gRNA質(zhì)粒構(gòu)建、高效gRNA序列篩選、病毒包裝和細(xì)胞系建立等多種靈活性服務(wù)，滿足科研工作者不同的實(shí)驗(yàn)需求；

2. 服務(wù)種類多：維真生物可以提供單gRNA質(zhì)粒構(gòu)建，多合1 gRNA質(zhì)粒構(gòu)建和gRNA pool & gRNA mix質(zhì)粒構(gòu)建；

①4 gRNA mix質(zhì)粒構(gòu)建—— 保證有效 & 選擇性多

該服務(wù)是將4條gRNA序列克隆至Cas9 + gRNA all in one慢病毒質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒不僅可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可包裝成慢病毒。但是，考慮到重組載體比較大對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄效率的影響，我們強(qiáng)烈推薦您直接選擇慢病毒成品。

②gRNA pool質(zhì)粒構(gòu)建—— 編輯效率大大提高

維真生物采用特殊的生產(chǎn)工藝針對(duì)同一基因構(gòu)建gRNA pool質(zhì)粒，大大提高了目的基因的編輯效率。

3. 質(zhì)粒數(shù)量多：維真生物可以提供單載體、雙載體；腺病毒載體、慢病毒載體和AAV 載體；不同報(bào)告基因EGFP和RFP，不同真核抗性篩選基因puro和Blat、cre功能基因質(zhì)粒。

維真CRISPR/Cas9相關(guān)載體（部分）

腺病毒載體
……
慢病毒載體
……
AAV載體
……

4. 效果有保障：

維真生物建立了一套簡捷和可重復(fù)的基因敲除效果檢測(cè)系統(tǒng)——熒光法，克服了常規(guī)檢測(cè)方法的弊端，操作簡單、周期短、敲除效果檢測(cè)不受細(xì)胞類型的限制、實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀可靠！

設(shè)計(jì)策略如下：

咨詢更多CRISPR/Cas9相關(guān)產(chǎn)品和服務(wù)請(qǐng)撥打技術(shù)熱線電話400-077-2566。

參考文獻(xiàn)及客戶代表性文獻(xiàn)

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參考文獻(xiàn)：

[1]. Young, C.S., A.D. Pyle and M.J. Spencer, CRISPR for Neuromuscular Disorders: Gene Editing and Beyond. Physiology (Bethesda), 2019. 34(5): p. 341-353.

[2]. Gupta, D., et al., CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sci, 2019. 232: p. 116636.

客戶代表性文獻(xiàn)：

1. Science Advances. (IF=13.116). Sun, et.al. (2020). Development of a CRISPR-SaCas9 system for projection- and function-specific gene editing in the rat brain.［北京大學(xué) CRISPR-saCas9 基因編輯雄性SD大鼠特定神經(jīng)元群］；

2. Int. J. Mol. Sci. (IF=4.556). Xu, et al. (2020). Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle.［上海交通大學(xué) AdV-CRISPR system(pAdM-U6-gRNA1-U6-gRNA2-CMV-spCas9) 雞胚成纖維細(xì)胞DF-1 MOI=1000 & 雞肌肉注射 雞骨骼肌的生長和發(fā)育］；

3. Retrovirology. (IF=4.183). Wang, et.al. (2017). Genome modifcation of CXCR4 by Staphylococcus aureus Cas9 renders cells resistance to HIV-1 infection.［武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 AAV-SaCas9-CXCR4-gRNA HIV基因治療］。