索拉非尼 (Sorafenib )是一種口服的多靶點(diǎn)、多激酶抑制劑，可以靶向作用于腫瘤細(xì)胞及腫瘤血管上的絲氨酸/蘇氨酸激酶及受體酪氨酸激酶等，具有抗血管生成和抗腫瘤細(xì)胞增殖的雙重作用，已被批準(zhǔn)用于晚期肝細(xì)胞癌、晚期腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌患者的治療。對(duì)于大多數(shù)患者來(lái)說(shuō)，索拉非尼都是一種可以產(chǎn)生良好療效的藥物，但是索拉非尼所誘發(fā)的不良反應(yīng)——高發(fā)生率的手足皮膚反應(yīng)（hand-foot skin reaction，HFSR）仍限制了其臨床應(yīng)用，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)報(bào)告表明，索拉非尼所致的HFSR的發(fā)病率在30%到76%不等。
HFSR以掌和足底角化過(guò)度（角質(zhì)層增厚）為特征，通常是由角質(zhì)形成細(xì)胞的表皮穩(wěn)態(tài)異常引起的，包括過(guò)度增殖和過(guò)度分化，因而角質(zhì)形成細(xì)胞功能障礙在很大程度上被認(rèn)為是索拉非尼誘導(dǎo)HFSR的主要原因。但是基于這一概念的干預(yù)策略后續(xù)被研究者證明是無(wú)效的，例如，通過(guò)預(yù)防性去除過(guò)度角化區(qū)，使用保濕霜來(lái)控制足底的過(guò)度角化，給患者更換軟鞋或者軟鞋墊等方式，這些措施對(duì)于嚴(yán)重HFSR患者的緩解作用甚微。所以對(duì)于重度的HFSR患者，仍需要減少索拉非尼劑量或中斷使用，降低所帶來(lái)的極大的HFSR副反應(yīng)。但減少或者中斷索拉非尼的使用，不僅會(huì)降低癌癥治療效果，甚至?xí)?dǎo)致癌癥的惡化。由于目前對(duì)藥物引發(fā)皮膚毒性的潛在機(jī)制知之甚少，因此迫切需要基于索拉非尼誘導(dǎo)HFSR的潛在機(jī)制開(kāi)發(fā)出有效的干預(yù)措施。
2020年，浙江大學(xué)和杭州市第一人民醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)在《Cell Research》（IF=20.507）上聯(lián)合發(fā)表了題為“s-HBEGF/SIRT1 circuit-dictated crosstalk between vascular endothelial cells and keratinocytes mediates sorafenib-induced hand-foot skin reaction that can be reversed by nicotinamide”的研究論文。該研究揭示了血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞角質(zhì)化的機(jī)制，并為索拉非尼誘發(fā)的HFSR提供了潛在的治療策略。
本研究中，研究者證實(shí)了血管內(nèi)皮細(xì)胞是索拉非尼誘發(fā)HFSR的主要細(xì)胞靶點(diǎn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的可溶性肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子s-HBEGF激活了角質(zhì)形成細(xì)胞上的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidergrowth factor receptor，EGFR)，促進(jìn)下游JNK2蛋白的磷酸化，進(jìn)而穩(wěn)定了角質(zhì)形成細(xì)胞中必不可少的角化誘導(dǎo)劑SIRT1，并最終引起HFSR的發(fā)生。此外，研究人員進(jìn)一步證明了SIRT1抑制劑煙酰胺可以逆轉(zhuǎn)索拉非尼誘發(fā)的HFSR。從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，再到初步臨床研究，研究人員成功應(yīng)用SIRT1抑制劑煙酰胺顯著改善了10余例服用索拉非尼導(dǎo)致HFSR的患者癥狀，揭示了煙酰胺可能是一種很有前途的抗索拉非尼誘發(fā)HFSR的臨床治療方法。
1. 血管內(nèi)皮細(xì)胞參與索拉非尼誘發(fā)的角化過(guò)度
研究者首先通過(guò)人角質(zhì)形成細(xì)胞來(lái)測(cè)試索拉非尼對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的直接影響。使用人原代角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞（人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞），并以角蛋白5（KRT5）和角蛋白14（KRT14）為細(xì)胞增殖標(biāo)記，以角蛋白1（KRT1）、角蛋白10（KRT10）、兜甲蛋白（LORICRIN）和外皮蛋白（IVL）作為細(xì)胞分化標(biāo)記，測(cè)試了索拉非尼對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的直接影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，索拉非尼沒(méi)能直接誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，也沒(méi)有誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。這說(shuō)明，索拉非尼并不直接對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生影響而引起角化過(guò)度。
接著，研究者開(kāi)始探尋引發(fā)HFSR的可能因素。目前已經(jīng)有報(bào)道指出，血管內(nèi)皮細(xì)胞是索拉非尼的細(xì)胞靶點(diǎn)之一，在抗血管生成的治療中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的抗體貝伐單抗顯著增加了索拉非尼誘導(dǎo)的HFSR的總發(fā)生率。與此同時(shí)，作者也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了索拉非尼對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖有抑制作用?；谶@些研究發(fā)現(xiàn)，研究者提出以下假設(shè)：血管內(nèi)皮細(xì)胞是否參與了索拉非尼誘導(dǎo)的HFSR。
為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者首先建立了一個(gè)模型來(lái)研究血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的影響，研究者用二甲基亞砜或索拉非尼孵育HUVECs（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）24 h，再用該條件培養(yǎng)基(CdMCTRL或CdMSORA)孵育角質(zhì)形成細(xì)胞24 h，研究發(fā)現(xiàn)CdMSORA對(duì)細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響，但角質(zhì)形成細(xì)胞中四種分化標(biāo)志物((KRT1，KRT10，LORICRIN和IVL)在mRNA表達(dá)水平上的表達(dá)明顯增加，這提示，索拉非尼通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)了角質(zhì)形成細(xì)胞的分化（圖1）。
圖1. 血管內(nèi)皮細(xì)胞參與索拉非尼誘發(fā)的HFSR
2. 血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)釋放s-HBEGF參與調(diào)節(jié)索拉非尼誘發(fā)的HFSR
接著，研究者又對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分化的驅(qū)動(dòng)因素進(jìn)行了探究。在用索拉非尼處理的HUVEC培養(yǎng)基中，通過(guò)質(zhì)譜分析檢測(cè)到了HBEGF，據(jù)報(bào)道掌跖角化病的發(fā)生與s-HBEGF（可溶性的HBEGF）水平升高有關(guān)。為了進(jìn)一步探討s-HBEGF水平與HFSR嚴(yán)重程度的關(guān)系，研究者檢測(cè)了10例經(jīng)索拉非尼治療后確診的HFSR患者的血清，ELISA結(jié)果顯示，與健康人相比，HFSR患者的血清中s-HBEGF的表達(dá)水平明顯增加，并且HFSR越嚴(yán)重，s-HBEGF的水平越高，這說(shuō)明，s-HBEGF可能在索拉非尼誘發(fā)的HFSR中起關(guān)鍵作用。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證s-HBEGF是否確實(shí)能夠介導(dǎo)索拉非尼誘導(dǎo)的HFSR，研究者進(jìn)行了一系列體外實(shí)驗(yàn)。首先，研究者用s-HBEGF重組蛋白（重組蛋白的濃度與索拉非尼處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度成正比）處理人原代角質(zhì)形成細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞，細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的增殖幾乎沒(méi)有變化，但是幾種細(xì)胞分化標(biāo)記物的mRNA水平明顯升高，表明s-HBEGF確實(shí)具有促角質(zhì)化的作用。然后，研究者使用了HBEGF中和抗體阻斷s-HBEGF的功能，發(fā)現(xiàn)CdMSORA誘導(dǎo)的角化過(guò)度被顯著逆轉(zhuǎn)，并且HaCaT細(xì)胞中四種分化標(biāo)記物的mRNA水平均顯著下降。此外，研究者還構(gòu)建了HBEGF基因沉默的HUVECs，發(fā)現(xiàn)在HBEGF基因敲低的HUVECs中，CdMSORA未能增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞角化。
接著，研究者又通過(guò)一系列體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，開(kāi)發(fā)出索拉非尼治療小鼠模型，實(shí)驗(yàn)組小鼠注射HBEGF中和抗體，對(duì)照小鼠注射等量的IgG，30天后測(cè)量小鼠的角質(zhì)層厚度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與給予IgG的索拉非尼組小鼠相比，注射HBEGF中和抗體的索拉非尼治療組的小鼠，角質(zhì)層厚度顯著降低，這說(shuō)明HBEGF中和抗體幾乎可完全逆轉(zhuǎn)索拉非尼誘發(fā)的角質(zhì)層增厚。接著，研究者又對(duì)小鼠模型血清樣本中s-HBEGF的濃度進(jìn)行了檢測(cè)，與預(yù)期一致，索拉非尼治療組小鼠的s-HBEGF水平顯著高于對(duì)照組，而抗體治療顯著降低了s-HBEGF的水平。值得注意的是，索拉非尼治療后表達(dá)最厚角質(zhì)層的小鼠具有最高濃度的s-HBEGF。（圖2）。
最后，研究者又探索了在沒(méi)有索拉非尼存在的情況下，s-HBEGF是否可以誘導(dǎo)HFSR的產(chǎn)生。將靜脈注射重組小鼠s-HBEGF蛋白注射入小鼠體內(nèi)，分析小鼠角質(zhì)層厚度，發(fā)現(xiàn)s-HBEGF特異性組的角質(zhì)層厚度和分化標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。這些結(jié)果證實(shí)了s-HBEGF在體內(nèi)可以直接誘導(dǎo)角質(zhì)化的發(fā)生。
上述結(jié)果表明，s-HBEGF在索拉非尼誘導(dǎo)的HFSR中介導(dǎo)了血管內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用，具體表現(xiàn)為索拉非尼能促進(jìn)HUVECs釋放s-HBEGF，加強(qiáng)角質(zhì)化，并可進(jìn)一步導(dǎo)致HFSR的發(fā)生。
圖2. s-HBEGF與索拉非尼誘導(dǎo)的角化過(guò)度有關(guān)
3. s-HBEGF通過(guò)磷酸化JNK2穩(wěn)定SIRT1進(jìn)而調(diào)控索拉非尼誘發(fā)的HFSR
盡管s-HBEGF被報(bào)道參與了許多角化性疾病，但是潛在的調(diào)控機(jī)制仍然不清楚。有研究表明，s-HBEGF可以通過(guò)結(jié)合EGFR受體激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在這一發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)下，研究者試圖揭開(kāi)s-HBEGF觸發(fā)的過(guò)度角化病的機(jī)制。作者構(gòu)建了EGFR沉默的HaCaT細(xì)胞，檢測(cè)EGFR對(duì)過(guò)度角質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)沉默HaCaT細(xì)胞中的EGFR的表達(dá)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖幾乎沒(méi)有影響，但其4種分化標(biāo)記物的表達(dá)水平被逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為mRNA表達(dá)水平的明顯下降，表明EGFR作為s-HBEGF受體在索拉非尼介導(dǎo)的角化過(guò)度中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
為了確定s-HBEGF刺激EGFR的效應(yīng)因子，在s-HBEGF重組蛋白處理的HaCaT細(xì)胞中，研究者檢測(cè)了四個(gè)經(jīng)典的下游通路（AKT，STAT3、MEK和JNK1/2）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，只有磷酸化的JNK（p-JNK1/2）水平升高，而p-JNK1和JNK1水平?jīng)]有變化。因此研究者又通過(guò)JNK2沉默來(lái)研究JNK2在s-HBEGF觸發(fā)的角化過(guò)度中的作用，發(fā)現(xiàn)在p-JNK1和JNK1水平不變的情況下敲低JNK2時(shí)，能顯著降低角質(zhì)形成細(xì)胞的分化，而不影響HaCaT細(xì)胞的增殖?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，研究者得出，EGFR-JNK2通路的激活可能是索拉非尼誘導(dǎo)角化過(guò)度的重要環(huán)節(jié)（圖3）。
圖3. EGFR-JNK2通路參與索拉非尼誘導(dǎo)的角化過(guò)度
據(jù)報(bào)道，JNK2可以磷酸化和穩(wěn)定SIRT1，而SIRT1與角質(zhì)形成細(xì)胞的分化有關(guān)?；谶@一點(diǎn)，研究者對(duì)SIRT1的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，通過(guò)Western blot和免疫組織化學(xué)染色觀察到，在CdMSORA或s-HBEGF重組蛋白處理的角質(zhì)形成細(xì)胞以及索拉非尼或s-HBEGF處理的鼠爪中，SIRT1的表達(dá)水平確有增加。然而相反的是，與索拉非尼治療組相比，HBEGF抗體和索拉非尼聯(lián)合治療組中SIRT1的表達(dá)水平降低。為了進(jìn)一步證實(shí)s-HBEGF激活的JNK2可以穩(wěn)定角質(zhì)形成細(xì)胞中的SIRT1，研究者首先證明了JNK2的敲除抵消了s-HBEGF增強(qiáng)的SIRT1的表達(dá)。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)s-HBEGF重組蛋白可以延長(zhǎng)SIRT1在蛋白合成抑制劑CHX作用下的降解時(shí)間，并且可以磷酸化SIRT1第27位絲氨酸，同時(shí)抑制其泛素化。敲低JNK2后可以顯著逆轉(zhuǎn)s-HBEGF對(duì)SIRT1的穩(wěn)定作用。因此，s-HBEGF激活的JNK2可以穩(wěn)定角質(zhì)形成細(xì)胞中的SIRT1（圖4）。
圖4. s-HBEGF通過(guò)JNK2穩(wěn)定SIRT1進(jìn)而誘導(dǎo)角化過(guò)度
基于以上研究，作者假設(shè)SIRT1被p-JNK2穩(wěn)定后會(huì)導(dǎo)致角化過(guò)度，為了證明這一點(diǎn)，作者評(píng)估了SIRT1沉默對(duì)索拉非尼誘導(dǎo)的過(guò)度角化的影響。通過(guò)敲低SIRT1，發(fā)現(xiàn)CdMSORA或s-HBEGF重組蛋白處理下角質(zhì)形成細(xì)胞的分化有所降低，而不影響細(xì)胞的增殖。表明SIRT1的確具有促進(jìn)索拉非尼誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞的分化。
接下來(lái)，研究者又進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，確定SIRT1在索拉非尼體內(nèi)誘導(dǎo)HFSR中的意義：將AAV1-shRNA-Sirt1（維真生物提供，病毒滴度為1.98×10E13 vg/mL；每只鼠爪注射2.5×10E11 vg） 通過(guò)皮下注射到小鼠爪子中，結(jié)果顯示Sirt1的敲低逆轉(zhuǎn)了索拉非尼引起的角質(zhì)層增厚，并且降低了角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)記物的水平（圖5）。
綜上所述，JNK2被s- HBEGFf受體EGFR激活后發(fā)生磷酸化進(jìn)而穩(wěn)定SIRT1引起角化過(guò)度。
圖5. SIRT1參與索拉非尼誘導(dǎo)的角化過(guò)度
