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Nat Neurosci ‖ 揭秘內(nèi)側(cè)視前區(qū)拮抗性介導(dǎo)壓力引起的焦慮和父母行為

當(dāng)今社會(huì)的快速發(fā)展給現(xiàn)代人帶來了巨大的壓力，越來越多的人普遍患有不同程度的焦慮癥。焦慮本身是一種正常的情感表現(xiàn)，是個(gè)人對即將來臨的、可能會(huì)造成的危險(xiǎn)或威脅所產(chǎn)生的緊張、不安、憂慮、煩惱等不愉快的復(fù)雜情緒狀態(tài)。適度的焦慮情緒能鞭策我們提前做好準(zhǔn)備以更好地應(yīng)對潛在威脅；而過度或持續(xù)存在的焦慮則會(huì)干擾記憶、思維等正常的心理活動(dòng)，影響日常生活狀態(tài)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)形成情感性或生理性疾病。為改善現(xiàn)有的或開發(fā)新的焦慮癥治療策略，我們有必要徹底了解控制焦慮狀態(tài)的神經(jīng)回路。

已知焦慮是由大腦中廣泛分布的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)控制的，以往的研究進(jìn)展主要集中于杏仁核、終紋床核（BNST）、室旁核（PVN）等腦部區(qū)域神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對焦慮狀態(tài)的調(diào)節(jié)，但介導(dǎo)焦慮狀態(tài)啟動(dòng)、維持的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和神經(jīng)回路仍不明確，依然需要進(jìn)一步的探索。

2021年2月1日，南加州大學(xué)Huizhong Whit Tao和Li I. Zhang團(tuán)隊(duì)在《Nature Neuroscience》雜志上發(fā)表了題為“Medial preoptic area antagonistically mediates stress-induced anxiety and parental behavior”的文章，揭示了小鼠內(nèi)側(cè)視前區(qū)（mPOA）的谷氨酸能神經(jīng)元和GABA能神經(jīng)元可拮抗性調(diào)節(jié)壓力引起的焦慮和父母行為，闡明了mPOA是協(xié)調(diào)焦慮和父母行為的關(guān)鍵中心，并可能成為治療焦慮癥的靶向目標(biāo)。

物理應(yīng)激可激活mPOA谷氨酸能神經(jīng)元

首先，作者給予了實(shí)驗(yàn)鼠幾種不同類型的物理應(yīng)激刺激，包括強(qiáng)迫游泳、電熱板和電擊，1小時(shí)后使用常用的評價(jià)小鼠焦慮水平的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：開場試驗(yàn)（OFT）和高架十字迷宮（EPM）試驗(yàn)測試應(yīng)激對小鼠產(chǎn)生的焦慮作用。作者發(fā)現(xiàn)與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠在OFT中心區(qū)和EPM開臂區(qū)探索的時(shí)間減少，表明暴露于壓力源后小鼠的焦慮狀態(tài)有所升高。

接著，作者通過c-fos染色檢測在應(yīng)急刺激后大腦的哪些區(qū)域表現(xiàn)出急性或長時(shí)間的活動(dòng)。結(jié)果顯示，與對照組相比，三種應(yīng)激刺激下的實(shí)驗(yàn)鼠的mPOA中c-Fos蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)明顯升高，表明應(yīng)激條件下小鼠mPOA區(qū)表現(xiàn)出了急性或長期反應(yīng)。并且c-Fos和2型囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Vglut2) 信號(hào)的共定位結(jié)果表明，在激活的mPOA神經(jīng)元中80%以上都是谷氨酸能神經(jīng)元；鈣信號(hào)監(jiān)測也證明了mPOA谷氨酸能神經(jīng)元可被各種類型的物理應(yīng)激源急性激活；并且在應(yīng)激源刺激下mPOA谷氨酸能神經(jīng)元自發(fā)放電活性增加的時(shí)間與應(yīng)激后焦慮狀態(tài)持續(xù)的時(shí)間相一致。

物理應(yīng)激激活mPoA谷氨酸能神經(jīng)元

激活mPOA谷氨酸能神經(jīng)元誘導(dǎo)負(fù)價(jià)和焦慮行為

為測試mPOA是否與應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮有關(guān)，作者使用光遺傳學(xué)刺激Vglut2-Cre小鼠的mPOA谷氨酸能神經(jīng)元，并進(jìn)行了雙室（LED-on/LED-off）實(shí)時(shí)位置偏好測試（PPT），結(jié)果顯示，mPOA谷氨酸能神經(jīng)元被激活的Vglut2-Cre鼠在LED-on室的時(shí)間極少，激活mPOA谷氨酸能神經(jīng)元會(huì)讓小鼠產(chǎn)生厭惡情緒。

接著，作者進(jìn)一步探索增加mPOA谷氨酸能神經(jīng)元活性是否可以顯著增強(qiáng)焦慮樣行為。發(fā)現(xiàn)通過LED光的連續(xù)刺激，實(shí)驗(yàn)鼠在OFT中心區(qū)和EPM開臂區(qū)探索的時(shí)間均減少，并出現(xiàn)瞳孔擴(kuò)張和運(yùn)動(dòng)量增加的高度警覺狀態(tài)，而高喚醒和高警覺的行為狀態(tài)與焦慮相關(guān)。同樣地，作者還采用化學(xué)遺傳學(xué)方式激活小鼠mPOA谷氨酸能神經(jīng)元，得到的結(jié)果與光遺傳學(xué)刺激的現(xiàn)象相一致。另外，多項(xiàng)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，強(qiáng)烈激活mPOA谷氨酸能神經(jīng)元能明顯引起小鼠的極度厭惡情緒。這些結(jié)果表明，mPOA谷氨酸能神經(jīng)元活性的增加促進(jìn)了小鼠焦慮樣行為的產(chǎn)生。

mPOA谷氨酸能神經(jīng)元的激活會(huì)增強(qiáng)焦慮行為

抑制mPOA谷氨酸能神經(jīng)元能減輕焦慮行為

既然mPOA谷氨酸能神經(jīng)元能誘導(dǎo)并增強(qiáng)焦慮的發(fā)生，那么抑制其活性是否能減輕小鼠焦慮行為的發(fā)生呢？對此作者展開了研究。使用化學(xué)遺傳學(xué)以及光遺傳學(xué)技術(shù)沉默Vglut2-Cre鼠的mPOA谷氨酸能神經(jīng)元，結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)鼠在OFT中心區(qū)和EPM開臂區(qū)探索的時(shí)間要更長，這些結(jié)果表明，抑制mPOA谷氨酸能神經(jīng)元能減輕應(yīng)激源誘導(dǎo)的小鼠焦慮樣行為。

沉默mPOA谷氨酸能神經(jīng)元可以減少應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮行為

mPOA拮抗調(diào)節(jié)社會(huì)壓力誘發(fā)的焦慮和父母行為

以往的研究表明mPOA與社會(huì)行為有關(guān)，如養(yǎng)育子女和社會(huì)偏好。那么，mPOA是否也在社交誘發(fā)的焦慮中發(fā)揮作用呢？作者將一只年輕的雄鼠(作為入侵者)/外來幼仔引入一只未交配過的雄鼠籠中，OFT和EPM測試結(jié)果表明這一操作加強(qiáng)了原雄性小鼠的焦慮樣行為，說明雄性入侵鼠和外來幼仔對原雄性小鼠來說是一種社會(huì)壓力源。通過鈣活性成像，作者發(fā)現(xiàn)與入侵鼠或外來幼仔的互動(dòng)引發(fā)了原雄性小鼠mPOA谷氨酸能神經(jīng)元鈣活性的大幅增加。相比之下，當(dāng)未交配的雄性小鼠與雌性入侵鼠互動(dòng)，或未交配的雌性小鼠與外來幼仔互動(dòng)時(shí)，沒有觀察到鈣活性的增加。以上結(jié)果表明，mPOA谷氨酸能神經(jīng)元可以被社會(huì)性壓力刺激激活，但不能被社會(huì)性獎(jiǎng)勵(lì)激活。

而利用光遺傳學(xué)沉默掉mPOA谷氨酸能神經(jīng)元后，作者發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠再次處于社交壓力時(shí)，原雄性鼠與入侵雄鼠間的攻擊行為大大減少，并且OFT和EPM測試結(jié)果也顯示小鼠焦慮樣行為減輕，這表明mPOA谷氨酸能神經(jīng)元也介導(dǎo)了由社會(huì)壓力誘導(dǎo)的焦慮行為的表達(dá)。此外，mPOA谷氨酸能神經(jīng)元的失活也在很大程度上抑制了原雄性鼠對外來幼仔的攻擊行為，而父母行為有所加強(qiáng)。作者還通過其他的分析證實(shí)，即便是在非應(yīng)激狀態(tài)下，沉默mPOA谷氨酸能神經(jīng)元也能減少焦慮樣行為，這說明，mPOA谷氨酸能神經(jīng)元也可以調(diào)節(jié)基礎(chǔ)水平的焦慮樣行為。

綜上所述，當(dāng)焦慮狀態(tài)被抑制時(shí)，社會(huì)攻擊減少，而父母行為則會(huì)得到加強(qiáng)（雌雄鼠均如此），mPOA介導(dǎo)的情緒狀態(tài)與社會(huì)行為密切相關(guān)。

mPOA谷氨酸能神經(jīng)元拮抗調(diào)節(jié)社會(huì)壓力誘導(dǎo)的焦慮和父母行為

mPOA-PAG通路調(diào)節(jié)焦慮行為

接下來，作者探索了mPOA的下游靶點(diǎn)，通過熒光示蹤發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的mPOA谷氨酸能神經(jīng)元的軸突強(qiáng)烈地投射到PAG（中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)）、下丘腦外側(cè)區(qū)和上乳頭體三個(gè)區(qū)域，但是通過光刺激實(shí)驗(yàn)觀察到，只有當(dāng)mPOA到PAG的通路被光激活時(shí)才會(huì)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生焦慮行為，因此作者將研究重點(diǎn)放在了PAG上。

作者將AAVretro-Cre（1.5×10E14 GC/ml，維真生物提供）注射入Ai14小鼠（Cre依賴tdTomato報(bào)告基因小鼠）的PAG中，對mPOA神經(jīng)元進(jìn)行逆行標(biāo)記。首先，作者通過光激活mPOA谷氨酸能神經(jīng)元，在記錄的PAG神經(jīng)元中觀察到LED誘發(fā)的單突觸興奮性突觸后電流（EPSCs），證實(shí)了PAG神經(jīng)元能接收來自mPOA的直接興奮性輸入，確認(rèn)了功能連接性。接著，作者在自由活動(dòng)的小鼠PAG上方植入光纖通過光刺激來特異性地激活mPOA谷氨酸能終末端，經(jīng)過多項(xiàng)測試作者發(fā)現(xiàn)，刺激后小鼠表現(xiàn)出的焦慮樣行為與直接刺激mPOA的結(jié)果相類似。為進(jìn)一步證明mPOA-PAG通路的作用，作者利用光遺傳學(xué)刺激雙向（順行和逆行）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到的結(jié)果與刺激mPOA-PAG軸突的結(jié)果一致，均表現(xiàn)為焦慮樣行為的減輕。此外，作者還通過化學(xué)遺傳學(xué)特異性沉默mPOA谷氨酸能神經(jīng)元→PAG軸突末梢，同樣發(fā)現(xiàn)焦慮樣行為的減輕，上述實(shí)驗(yàn)共同證實(shí)了mPOA谷氨酸能神經(jīng)元-PAG通路促進(jìn)產(chǎn)生焦慮樣行為。

接著，作者又進(jìn)一步研究了谷氨酸能mPOA→腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）通路是否參與調(diào)節(jié)焦慮。結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷氨酸能mPOA→腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）的軸突數(shù)量稀疏，這些軸突的激活僅引發(fā)了小鼠較弱的厭惡行為，但不影響焦慮相關(guān)行為。一系列數(shù)據(jù)指出，mPOA谷氨酸能神經(jīng)元主要通過投射到PAG區(qū)增強(qiáng)焦慮樣行為。

mPOA神經(jīng)元的逆行標(biāo)記

mPOA GABA能神經(jīng)元在調(diào)節(jié)焦慮和父母行為方面起相反的作用

已知在mPOA中超過一半的神經(jīng)元是GABA能神經(jīng)元，于是，作者針對“GABA能神經(jīng)元是否也在調(diào)節(jié)焦慮行為中發(fā)揮作用”這一問題展開了探討。使用Slc32a1-Cre (Vgat-Cre)小鼠，光激活mPOA GABA能神經(jīng)元后，雌雄鼠均產(chǎn)生了強(qiáng)烈的正面情緒，同時(shí)在OFT中心區(qū)和EPM開臂區(qū)探索的時(shí)間均明顯增加。此外，mPOA GABA能神經(jīng)元的激活也增強(qiáng)了雌雄鼠的父母行為，同時(shí)減少了攻擊行為。這說明，mPOA GABA能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元在調(diào)節(jié)焦慮狀態(tài)和父母行為方面發(fā)揮相反的作用。

mPOA GABA能神經(jīng)元在調(diào)節(jié)焦慮和父母行為方面起相反的作用

接著，通過光激活Vgat-Cre-Ai14小鼠的mPOA GABA能神經(jīng)元，作者監(jiān)測到強(qiáng)光誘導(dǎo)的單突觸抑制性突觸后電流（IPSCs），這說明GABA能神經(jīng)元可局部抑制谷氨酸能神經(jīng)元，并且腦片鉗記錄顯示GABA能神經(jīng)元對PAG神經(jīng)元有直接抑制性輸入。此外，光激活GABA能神經(jīng)元→PAG后，小鼠產(chǎn)生了正面情緒，焦慮行為減輕，同時(shí)其父母行為增強(qiáng)。以上數(shù)據(jù)表明，mPOA GABA能神經(jīng)元不僅通過局部抑制谷氨酸能神經(jīng)元，而且通過向PAG輸入競爭性(即抑制性)投射的方式，拮抗谷氨酸能神經(jīng)元的方式調(diào)節(jié)焦慮和父母行為。

最后，作者通過細(xì)胞類型特異性逆行追蹤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)mPOA可能整合了來自LS、BNST和PVN等多個(gè)腦區(qū)的信息輸入，進(jìn)而調(diào)節(jié)焦慮行為。