腺病毒-PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)
眾所周知，慢病毒載體作為基因傳遞的工具很大一個優(yōu)勢就是具有整合特性，非常適合構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，但包裝容量小、病毒滴度低也是限制它大顯身手的弊端所在，因此只適合常規(guī)基因，而無法實現(xiàn)較大基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建。而AAV雖然是體內(nèi)研究的理想載體，但由于載體容量等原因也無法實現(xiàn)較大基因在體內(nèi)的長期穩(wěn)定表達。因此，開發(fā)一種新的基因傳遞工具對于較大基因的體內(nèi)外研究至關(guān)重要。
腺病毒包裝容量大，幾乎能感染所有類型的細胞，容易制得高滴度的病毒，而且非常適合體內(nèi)外研究，因此利用腺病毒來制備穩(wěn)轉(zhuǎn)株并實現(xiàn)基因在體內(nèi)的長期穩(wěn)定表達，可能是開發(fā)這一新型工具的重要突破口。然而，腺病毒感染細胞只能實現(xiàn)基因的瞬時表達，單從這一點考慮，恐難實現(xiàn)。如何才能發(fā)揮其長處，彌補其短板，是需要攻克的難點。
Gene delivery
這不，最近小編聽說，腺病毒已經(jīng)“拓展業(yè)務(wù)”跑來做穩(wěn)轉(zhuǎn)株了，這是怎么回事兒？原來，腺病毒深化了對外交往，與PiggyBac（PB）轉(zhuǎn)座子開展了合作。我們知道，PB轉(zhuǎn)座子是研究基因功能,制備轉(zhuǎn)基因動物及基因治療的優(yōu)良載體，具有廣泛宿主譜，通過“剪切-粘貼”機制介導(dǎo)外源基因的穩(wěn)定整合與表達。但其目前應(yīng)用的主要方式仍是通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，而質(zhì)粒載體本身存在轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、非整合等弊端。因此，本次腺病毒與PB的合作將是值得萬眾期待的。
腺病毒與PiggyBac（PB）強強聯(lián)合
一、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介紹
轉(zhuǎn)座子又稱跳躍因子，是基因組中一段可移動的DNA序列，它們可以直接從基因組的一個位點“跳躍”到另一個位點，轉(zhuǎn)座子發(fā)生位置轉(zhuǎn)移的過程即為轉(zhuǎn)座。轉(zhuǎn)座子載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)座時可攜帶一段外源DNA序列，從而實現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)移。根據(jù)轉(zhuǎn)座機制的不同，可將轉(zhuǎn)座子分為兩大類：逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和DNA轉(zhuǎn)座子。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子以RNA為媒介進行轉(zhuǎn)座，采用“復(fù)制-粘貼”機制，即先將自身DNA轉(zhuǎn)錄形成RNA中間產(chǎn)物, 再逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生新的DNA拷貝,最后插入基因組的其他位置實現(xiàn)轉(zhuǎn)座, 而原位點的轉(zhuǎn)座子保持不變。DNA轉(zhuǎn)座子則以DNA為媒介進行轉(zhuǎn)座，采用“剪切-粘貼”轉(zhuǎn)座機制，在轉(zhuǎn)座酶的作用下, 轉(zhuǎn)座子從原位置切除下來并整合到新的位點。DNA轉(zhuǎn)座子相對逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子而言，轉(zhuǎn)座效率高，易被人為改造，因而應(yīng)用較為廣泛，其具體轉(zhuǎn)座機制如圖1。
圖1. DNA轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座機制示意圖
野生型的DNA轉(zhuǎn)座子中通常含有轉(zhuǎn)座酶編碼序列，轉(zhuǎn)座酶通過識別轉(zhuǎn)座子兩端的ITR（反向末端重復(fù)序列），介導(dǎo)轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)移。經(jīng)人工改造后，中間的轉(zhuǎn)座酶編碼序列可被其它外源DNA序列所替換，在細胞中轉(zhuǎn)座酶存在的情況下發(fā)生轉(zhuǎn)座，從而將外源DNA插入基因組中，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因操作。
圖2. DNA轉(zhuǎn)座子實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因操作的機制示意圖
A:野生型DNA轉(zhuǎn)座子 B:人工修飾的轉(zhuǎn)座子載體 C:轉(zhuǎn)座酶表達載體
目前，已在真核生物中發(fā)現(xiàn)數(shù)10種DNA轉(zhuǎn)座子，具體分類和特征如下：
圖3. 真核生物DNA轉(zhuǎn)座子分類
轉(zhuǎn)座子可以在基因組任意位置插入和切除，常用于哺乳動物細胞基因編輯研究中。目前發(fā)現(xiàn)的可用于哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的DNA轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)主要有3類：類hAT轉(zhuǎn)座子Tol 2，兩個類Tc1轉(zhuǎn)座子Sleeping Beauty ( SB) 和 Frog Prince ( FP)，Piggy Bac超家族成員Piggy Bac（PB）。其中，PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)憑借其轉(zhuǎn)座效率高，宿主范圍廣等優(yōu)勢，近年來已在哺乳動物細胞中得到了廣泛的應(yīng)用，也是本文的介紹重點。
二、PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)
1、結(jié)構(gòu)特點
PB轉(zhuǎn)座子屬于DNA型轉(zhuǎn)座子，全長2476 bp。PB轉(zhuǎn)座子末端為長13 bp的反向重復(fù)序列（ITRs），在其內(nèi)部不對稱分布有19 bp的亞末端反向重復(fù)序列（sub-ITRs），sub-ITRs中間有一個1.8 kb的開放閱讀框，編碼594個氨基酸的piggyBac轉(zhuǎn)座酶，分子量為64 kDa，該轉(zhuǎn)座酶是轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座過程所必需的。
圖4. PB轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)示意圖
2、轉(zhuǎn)座模式
PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座遵循“剪切-粘貼”機制，在哺乳動物細胞基因組DNA中靶向TTAA序列。當piggyBac轉(zhuǎn)座酶蛋白在哺乳動物細胞中表達時，它會與轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列結(jié)合，切割DNA并釋放轉(zhuǎn)座子兩端的3’-OH，3’-OH攻擊互補鏈5’端的TTAA序列并形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而將轉(zhuǎn)座子從質(zhì)粒主鏈中釋放出來，斷裂的質(zhì)粒主鏈會在DNA連接酶的作用下重新連接起來而不留下任何痕跡。與此同時，目標染色體的特定位點（TTAA位點）被剪切為粘性末端雙鏈斷口，切下的PB轉(zhuǎn)座子在PB酶的作用下連入被切開的目標染色體中并把粘性末端補平，從而導(dǎo)致被插入目標染色體的轉(zhuǎn)座子兩側(cè)都存在TTAA。
在大多數(shù)應(yīng)用中，piggyBac轉(zhuǎn)座酶和piggyBac轉(zhuǎn)座子分別由兩個單獨的質(zhì)粒攜帶，通過瞬時轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入細胞，因而會逐漸丟失，轉(zhuǎn)座酶的丟失使轉(zhuǎn)座子在宿主基因組中實現(xiàn)永久整合。當細胞中再次表達PB轉(zhuǎn)座酶時，會把轉(zhuǎn)座子從宿主基因組上切除，使宿主基因組恢復(fù)原狀，序列不會發(fā)生任何改變，這稱為“無縫切除”。
圖5. PB轉(zhuǎn)座子的作用機制
3、優(yōu)勢
①轉(zhuǎn)座效率高。 PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)靶向于基因組的TTAA位點，而在基因組中TTAA序列出現(xiàn)較為頻繁，平均每246 bp便會出現(xiàn)一個TTAA位點。
②裝載容量大。PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)攜帶的外源片段可長達幾十Kb。
③可介導(dǎo)外源基因的穩(wěn)定整合和表達。
④插入位置易檢測。可利用反式PCR方法迅速而精確地進行突變位點的檢測。
⑤可以實現(xiàn)“無縫切除”。轉(zhuǎn)座酶的再次表達可將導(dǎo)入的外源基因切除, 而不影響內(nèi)源基因的表達。
三、腺病毒與轉(zhuǎn)座子聯(lián)手，助力體內(nèi)外研究
在實際應(yīng)用過程中，轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子分別被構(gòu)建在兩個載體上，而后導(dǎo)入細胞。無論是質(zhì)粒組還是腺病毒組，添加轉(zhuǎn)座酶組細胞存活數(shù)量要遠遠多于未添加組，說明轉(zhuǎn)座酶在轉(zhuǎn)座過程中的必需性；而腺病毒組細胞存活數(shù)量整體多于質(zhì)粒組，說明腺病毒轉(zhuǎn)座體系的效率更強。（圖A、B為質(zhì)粒轉(zhuǎn)座體系，圖C、D為腺病毒轉(zhuǎn)座體系）
質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子體系 pk 腺病毒轉(zhuǎn)座子體系
1、腺病毒轉(zhuǎn)座體系較質(zhì)粒轉(zhuǎn)座體系效率更高
首先，我們將PB轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶分別構(gòu)建至腺病毒載體并包裝腺病毒，分別通過質(zhì)粒和病毒感染兩種方式處理A549細胞。發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時，Puro加壓7天后，加轉(zhuǎn)座酶組細胞大量存活，而對照組細胞幾乎全部凋亡。腺病毒感染48小時，Puro加壓兩周后，加轉(zhuǎn)座酶組細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)擴增，對照組細胞逐漸凋亡（如下圖所示）。這說明，轉(zhuǎn)座酶在轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座過程是必需的，且腺病毒轉(zhuǎn)座子比質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座效率更高。
質(zhì)粒組與病毒組實驗結(jié)果
2、腺病毒-PB轉(zhuǎn)座體系效率分析
為評估腺病毒-PB轉(zhuǎn)座體系的轉(zhuǎn)座效率，我們對腺病毒組存活細胞數(shù)量進行了分析。計數(shù)與染色結(jié)果顯示，加轉(zhuǎn)座酶組的存活細胞數(shù)量是未加轉(zhuǎn)座酶組的近33倍（如下圖所示）。
腺病毒組存活細胞數(shù)分析
結(jié)語
腺病毒與PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的融合，既可進行細胞的高效感染，又可實現(xiàn)外源基因在宿主細胞的穩(wěn)定整合與表達。因此，如果您有基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)需求，無論是常規(guī)基因還是較大基因，常規(guī)細胞還是難感染的細胞，體內(nèi)研究還是體外研究，都可以優(yōu)先選擇腺病毒-PB轉(zhuǎn)座體系。利用這一體系可以完美地解決穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建以及外源基因在動植物體、組織中穩(wěn)定表達的難題，尤其是對那些較大基因來說，這一體系尤其適用，歡迎各位老師咨詢訂購！
維真生物腺病毒-PB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)部分載體
|
載體名稱
|
啟動子
|
抗生素
|
熒光蛋白
|
|
pADM-PB-CMV-EGFP-mCMV-Puro
|
CMV
|
Puro
|
GFP
|
|
pADM-PBase
|
CMV
|
/
|
/
|
參考文獻
[1].Yusa, K., piggyBac Transposon. Microbiol Spectr, 2015. 3(2): p. MDNA3-0028-2014.
[2].Woodard, L.E. and M.H. Wilson, piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol, 2015. 33(9): p. 525-33.
[3].Hickman, A.B. and F. Dyda, DNA Transposition at Work. Chem Rev, 2016. 116(20): p. 12758-12784.
[4].Feschotte, C. and E.J. Pritham, DNA transposons and the evolution of eukaryotic genomes. Annu Rev Genet, 2007. 41: p. 331-68.
[5].Wu, S.C., et al., piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(41): p. 15008-13.
