RNA編輯神器CasRx上線！shRNA要退休？
CRISPR/Cas系統(tǒng)賦予了細(xì)菌和古細(xì)菌適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，用于抵抗入侵的噬菌體及外源DNA。根據(jù)效應(yīng)蛋白的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為兩類：第Ⅰ類，依賴于多種效應(yīng)蛋白介導(dǎo)靶目標(biāo)干擾；第Ⅱ類，以單一、多結(jié)構(gòu)域效應(yīng)蛋白為代表。第II類CRISPR/Cas系統(tǒng)又分為II、V和VI 3種類型。II型和V型效應(yīng)蛋白靶向于DNA分子，例如II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)，憑借其低成本、高效率和簡單易用等優(yōu)點(diǎn)，成為DNA編輯的強(qiáng)大工具，為基因操作和基因組研究帶來了革命性的改變。而VI CRISPR/Cas（CRISPR/Cas13）系統(tǒng)的獨(dú)特之處在于它們是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠降解RNA的蛋白，CRISPR/Cas13系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了CRISPR系統(tǒng)在病毒干擾方面的應(yīng)用。新發(fā)現(xiàn)的Cas13蛋白第四種亞型（Cas13d）的家族成員CasRx在體內(nèi)外哺乳動物細(xì)胞的RNA裂解過程中顯示出更強(qiáng)的特異性和更高的敲除效率，而且CasRx比之前發(fā)現(xiàn)的所有亞型都要小很多，更容易利用AAV載體實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的運(yùn)輸，因此在RNA編輯方面具有很大的應(yīng)用前景。
1. CRISPR/Cas13系統(tǒng)
2016年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了可以靶向RNA進(jìn)行切割的CRISPR/Cas13系統(tǒng)，該系統(tǒng)由單一的效應(yīng)蛋白Cas13和CRISPR RNA（crRNA）組裝形成一個(gè)由crRNA引導(dǎo)的RNA靶向效應(yīng)復(fù)合物。目前，Cas13家族共鑒定出四種亞型，包括Cas13a（又名C2c2）、Cas13b、Cas13c和Cas13d，四種Cas13亞型蛋白分子量均小于Cas9蛋白。所有Cas13蛋白均具有兩種不同的催化活性：①由兩個(gè)較高等的真核和原核核苷酸結(jié)合（Higher eukaryotes and prokaryotes nuceotide-binding，HEPN）結(jié)構(gòu)域提供的RNase活性，這是靶RNA降解所必需的。Cas13 四個(gè)亞型同源性較低，且同源序列僅限于HEPN結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)，此外兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域中的單點(diǎn)突變會使CRISPR/Cas13系統(tǒng)對RNA的切割能力完全喪失；②催化pre-crRNA加工和形成成熟crRNA的RNase活性。
圖1. VI CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖
與CRISPR II類系統(tǒng)的其它核酸酶結(jié)構(gòu)一致，Cas13a的整體結(jié)構(gòu)是雙葉的，N-末端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD）和Helical-1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成crRNA識別葉（REC lobe），HEPN1、Helical-2、HEPN2結(jié)構(gòu)域形成核酸酶葉（NUC lobe）（圖2）。CRISPR/Cas13b系統(tǒng)有兩種酶，分別是VI-B1和VI-B2，它們之間的區(qū)別在于Cas13b轉(zhuǎn)座子上攜帶的附屬蛋白的基因型不同，VI-B1的附屬蛋白是Csx28，而VI-B2的附屬蛋白是Csx27。絕大多數(shù)Cas13d型系統(tǒng)還含有包含 WYL結(jié)構(gòu)域的相關(guān)輔助蛋白，WYL結(jié)構(gòu)域通常與原核防御系統(tǒng)有關(guān)（圖1）。
圖2. Cas13a蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖
所有的Cas13蛋白酶都需要60- 66 nt的crRNA來確保靶向特異性。四種亞型crRNA都有一個(gè)促進(jìn)與相應(yīng)Cas13蛋白酶結(jié)合的直接重復(fù)（Direct repeat，DR）以及特異性靶向轉(zhuǎn)錄本的間隔序列。Cas13b的crRNA在3’端攜帶直接重復(fù)，而Cas13a、c和d的crRNA在5’端攜帶直接重復(fù)（圖3）。
圖3. 四種Cas13亞型對應(yīng)的crRNAs結(jié)構(gòu)示意圖
CRISPR/Cas13系統(tǒng)的防御機(jī)制主要包括以下幾個(gè)階段（以Cas13a為例）：①pre-crRNA 的識別與結(jié)合。新轉(zhuǎn)錄的pre-crRNA通過crRNA的5’端莖環(huán)結(jié)構(gòu)與Cas13a的REC葉識別并結(jié)合，形成pre-crRNA與Cas13a復(fù)合物的中間過渡態(tài)；②成熟crRNA的形成。NUC區(qū)的Helical-1和HEPN2結(jié)構(gòu)域之間保守殘基的構(gòu)象發(fā)生變化，從而形成一個(gè)酸堿催化中心，催化酶切pre-crRNA形成成熟的crRNA。此時(shí)的crRNA-Cas13a復(fù)合物處于無酶切活性狀態(tài)；③crRNA-Cas13復(fù)合物酶切活性的激活。靶ssRNA進(jìn)入crRNA-Cas13a復(fù)合物內(nèi)與crRNA發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，誘發(fā)Cas13a發(fā)生構(gòu)象變化，從而激活crRNA-Cas13a復(fù)合物的酶切活性；④靶RNA的降解。在crRNA的引導(dǎo)下，Cas13a的HEPN結(jié)構(gòu)域催化靶ssRNA的酶切。
有時(shí)細(xì)菌細(xì)胞中會出現(xiàn)非特異性酶切的情況，導(dǎo)致細(xì)胞中其他附屬ssRNA的降解，引起一定的細(xì)胞毒性，但這種現(xiàn)象在哺乳動物細(xì)胞中并未出現(xiàn)，其原因目前尚未可知。（圖4）。
圖4. CRISPR/Cas13系統(tǒng)作用機(jī)制示意圖
2. Cas13d的發(fā)現(xiàn)及優(yōu)勢
2018年，加州大學(xué)伯克利分校Patrick D. Hsu實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了靶向RNA的Cas13d家族，Cas13d平均大小為930 aa，是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物細(xì)胞中相對較小的Ⅱ類CRISPR效應(yīng)因子（比其家族成員Cas13a-c小20%，比Cas9小33%），使它更容易包裝到容量有限的應(yīng)用載體如AAV載體中。此外，Cas13d對RNA靶點(diǎn)的切割不依賴于PFS序列（protospacer flanking sequence，相當(dāng)于Cas9針對DNA的PAM序列），這極大的增加了Cas13d的應(yīng)用范圍，使其成為進(jìn)一步開發(fā)靶向RNA工具的潛在平臺。與RNA干擾技術(shù)相比，Cas13d介導(dǎo)的基因沉默具有更高的特異性（與數(shù)百個(gè)shRNA脫靶相比，Cas13d沒有脫靶）和敲除效率（Cas13d達(dá)到96％，shRNA達(dá)到65％， CRISPRi達(dá)到53％）。而與Cas9介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)相比，Cas13d介導(dǎo)的基因沉默不會改變基因組DNA，因此這種基因沉默是可逆的，對一些后天性疾病的治療更有優(yōu)勢（圖5，圖6）。
圖5. 一種引導(dǎo)和靶向激活Cas13d核糖核酸酶活性的模型
圖6. Cas13d系統(tǒng)具有更高的特異性和敲除效率
與此同時(shí)，Patrick D. Hsu實(shí)驗(yàn)室又鑒定出一種效果更佳的Cas13d酶：即來自腸道細(xì)菌黃化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）XPD3002，被命名為CasRx。隨后，科學(xué)家通過多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明了CasRx能在體內(nèi)外可高效敲除RNA。同時(shí)，CasRx蛋白由于體積小，編輯效率高，被認(rèn)為是在未來中極具應(yīng)用優(yōu)勢的Cas13蛋白。
3. CasRx的敲除效果驗(yàn)證
2020年的一項(xiàng)研究探索了使用CasRx系統(tǒng)來定向沉默基因的可行性。首先，研究者選擇Pten作為代謝調(diào)控基因，研究CasRx是否能以代謝基因?yàn)榘悬c(diǎn)進(jìn)行有效的基因敲除，并制備了多個(gè)針對Pten mRNA編碼序列的sgRNAs，研究者將CasRx和每個(gè)Pten sgRNA通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞中，并進(jìn)行sgRNA的體外篩選，找到了CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA組合：sgPten-5和sgPten-6。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染CasRx、sgPten-5和sgPten-6的N2a細(xì)胞中，Pten的表達(dá)水平顯著降低，AKT的磷酸化水平顯著升高，此外與shRNA系統(tǒng)相比，CasRx編輯系統(tǒng)表現(xiàn)出來更強(qiáng)的特異性和更低的脫靶率（圖7）。（延伸理解：Pten被認(rèn)為是一種代謝調(diào)節(jié)劑，通過抑制PI3K/AKT途徑抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Pten的缺失能促進(jìn)AKT的磷酸化）
圖7. CasRx體外介導(dǎo)Pten的敲除
研究人員通過尾靜脈注射敲低Pcsk9的AAV8病毒，顯著降低了肝臟和血清中Pcsk9的表達(dá)量以及血清中的膽固醇水平。重要的是，CasRx介導(dǎo)的Pcsk9敲低是可逆的，Pcsk9表達(dá)水平可以反復(fù)下調(diào)。CRISPR/CasRx系統(tǒng)為可逆調(diào)節(jié)代謝基因，尤其是一些后天性疾?。ㄈ缫虿涣忌盍?xí)慣導(dǎo)致的高血脂等后天代謝性疾病等）提供了一種有效的策略（圖8）。
圖8. CasRx介導(dǎo)的血清膽固醇降低和PCSK9可逆調(diào)節(jié)
4. 維真生物推出RNA編輯新產(chǎn)品——CasRx
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▽ 部分CasRx腺相關(guān)病毒（AAV）載體 ▽
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pAV-CMV-nls-CasRx
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pAV-CMV-nls-CasRx-P2A-GFP
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pAV-U6-gRNA-CMV-nls-CasRx
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pAV-U6-gRNA-CMV-nls-CasRx-P2A-GFP
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▽ 實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果 ▽
維真科研團(tuán)隊(duì)針對mcherry基因設(shè)計(jì)了多條gRNAs，并選擇了其中兩條敲除效果好的gRNAs（gRNA1和gRNA2），進(jìn)行了單條gRNA、2in1 gRNAs敲除效果的驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如下：
從上述熒光圖可看出，2in1 gRNAs敲除組，mCherry表達(dá)水平大大降低，敲除效果明顯好于單條gRNA的敲除效果。
（mcherry表達(dá)量：gRNA1組 0.38；gRNA2組 0.47；gRNA1+2組 0.18）
此外，從上圖mCherry mRNA表達(dá)量的檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，Cas13d(CasRx)-gRNA系統(tǒng)可以特異高效地降低靶向基因的表達(dá)（mCherry），并且2in1gRNAs 能實(shí)現(xiàn)mRNA水平敲低82%。
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5. 文獻(xiàn)參考
[1]. Mahas, A., R. Aman and M. Mahfouz, CRISPR-Cas13d mediates robust RNA virus interference in plants. Genome Biol, 2019. 20(1): p. 263.
[2]. Huynh, N., et al., A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila. Genome Biol, 2020. 21(1): p. 279.
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[4]. Konermann, S., et al., Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell, 2018. 173(3): p. 665-676.e14.
[5]. O'Connell, M.R., Molecular Mechanisms of RNA Targeting by Cas13-containing Type VI CRISPR-Cas Systems. J Mol Biol, 2019. 431(1): p. 66-87.
[6]. Liu, L., et al., The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a. Cell, 2017. 170(4): p. 714-726.e10.
