AAV在心臟研究中的靶向策略【應(yīng)用篇】
『應(yīng)用篇』AAV在腎臟研究中的案例分享
通過上一期AAV在心臟研究中的靶向策略（干貨篇）對rAAV在心臟實驗中的啟動子、血清型以及注射方式的選擇策略的學(xué)習(xí)，相信大家對rAAV在心臟研究中的應(yīng)用已有所了解，今天小V將和大家一起，通過幾個案例深入了解一下關(guān)于AAV在心臟研究中的具體應(yīng)用。
維真客戶AAV心臟注射實例 01
Zinc finger and BTB domain-containing protein 20 aggravates angiotensin II?induced cardiac remodeling via the EGFR?AKT pathway
ZBTB20（鋅指和BTB結(jié)構(gòu)域蛋白20）是來自POK家族的轉(zhuǎn)錄因子，被證明在維持心臟收縮中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但在心臟重構(gòu)中的作用尚未被闡明。本研究中，作者用血管緊張素II（Ang II）誘導(dǎo)小鼠心臟重塑模型，探討ZBTB20在心臟重構(gòu)中的作用。研究發(fā)現(xiàn)ZBTB20在Ang II誘導(dǎo)的心臟重塑和心肌細(xì)胞損傷反應(yīng)中表達(dá)升高；AAV9（心肌注射）介導(dǎo)的ZBTB20過表達(dá)，可導(dǎo)致心壁肥厚、心室擴(kuò)張、纖維化增加和射血分?jǐn)?shù)降低，而敲低ZBTB20后可保護(hù)心肌細(xì)胞免受Ang II誘導(dǎo)的肥大影響。從分子機(jī)制來看，ZBTB20通過EGFR-Akt信號通路加重Ang II誘導(dǎo)的心臟重塑反應(yīng)，本研究闡明了ZBTB20在不良心臟重構(gòu)向心力衰竭的轉(zhuǎn)變中的作用，并為誘導(dǎo)不良心臟重構(gòu)的分子機(jī)制提供了依據(jù)。
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病毒產(chǎn)品
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AAV9-ZBTB20 & AAV9-shZBTB20
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實驗動物
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8-10周齡雄性C57BL/6小鼠
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注射方式
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心肌注射
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注射量
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10 μl/site，1*10E11vp，三點(diǎn)注射
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如圖1所示，使用AAV9病毒載體在小鼠心臟中過表達(dá)ZBTB20， ZBTB20-NS組和ZBTB20-Ang II組ZBTB20蛋白表達(dá)水平均明顯升高，并且ZBTB20-Ang II組的ZBTB20蛋白表達(dá)水平高于ZBTB20-NS組。Ang II處理四周后，ZBTB20注射組較NC組心肺重量更高，同時小鼠左心室和心肌細(xì)胞肥大增加，這提示ZBTB20組出現(xiàn)心肌肥大和肺水腫。此外,多種不良心臟重構(gòu)和纖維化分子標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄增加，血管周圍和間質(zhì)纖維化變得更為嚴(yán)重，這些數(shù)據(jù)表明ZBTB20的過表達(dá)促進(jìn)了不良的心臟重構(gòu)發(fā)展為心力衰竭。
圖1. ZBTB20的過表達(dá)加重了心臟重構(gòu)
如圖2所示，使用AAV9 RNA干擾ZBTB20，WB檢測到ZBTB20蛋白水平大大降低。小鼠心肌細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染ZBTB20 siRNA后肥大反應(yīng)明顯降低，而且細(xì)胞表面積變小，心臟重構(gòu)分子標(biāo)志物Anp和β-Mhc的轉(zhuǎn)錄水平也有所降低，表明敲低ZBTB20可保護(hù)心肌細(xì)胞免受Ang II誘導(dǎo)的肥大影響。
圖2.敲低ZBTB20可保護(hù)心肌細(xì)胞免受Ang II誘導(dǎo)的肥大影響
維真客戶AAV心臟注射實例 02
MiR-590-5p inhibits pathological hypertrophy mediated heart failure by targeting RTN4
由各種心臟疾病導(dǎo)致的心力衰竭（HF）是造成當(dāng)今社會人群死亡的主要原因之一，目前尚無特別有效的治療方法，尋找新的標(biāo)志物對HF的診斷和治療具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)miR-590-3p可顯著增加幼鼠及成年大鼠心肌細(xì)胞的增殖，并且在肺動脈高壓兒童患者上腔靜脈血液中表達(dá)上調(diào)。網(wǎng)狀內(nèi)皮素4（RTN4）被證實在肥厚性心肌病動物模型中顯著上調(diào)，同時參與冠心病調(diào)控，可作為心衰的指標(biāo)。此外，RTN4還是miR-590-5p的預(yù)測下游靶點(diǎn)?；谶@些研究結(jié)果，研究人員探索了miR-590-3p和RTN4在HF中的關(guān)系。
研究人員采用主動脈弓縮窄術(shù)制備小鼠HF模型，并對小鼠心力衰竭的的病理進(jìn)程進(jìn)行分析觀察，發(fā)現(xiàn)miR-590-5p在HF小鼠心臟組織中表達(dá)下調(diào),尾靜脈注射AAV9-miR-590-5p可減輕心肌肥厚和心肌細(xì)胞凋亡。此外，miR-590-5p過表達(dá)可促進(jìn)H9C2細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，降低心肌重塑水平。機(jī)制上，miR-590-5p結(jié)合到RTN4 3 'UTR，通過負(fù)調(diào)控RTN4 調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞表型。綜上所述，miR-590-5p通過下調(diào)RTN4調(diào)控HF心肌肥厚和心肌細(xì)胞凋亡。
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病毒產(chǎn)品
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AAV9-miR-590-5p & AAV9-NC
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實驗動物
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8-10周齡雄性C57BL/6小鼠
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注射方式
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尾靜脈注射
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病毒滴度
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1*10E12vg/mL
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如圖3所示，通過RT-qPCR驗證AAV9-miR-590-5p在小鼠中的表達(dá)大幅提高。miR-590-5p的過表達(dá)降低了小鼠LVEDD（左心室舒張末期內(nèi)徑），減輕了小鼠心肌的水腫和肥厚。此外，miR-590-5p的過表達(dá)還顯著降低了小鼠心臟組織ANF、BNP和β-MHC(心臟重構(gòu)標(biāo)志物)的蛋白水平，同時使Bcl-2（細(xì)胞凋亡抑制基因）蛋白水平升高及Bax（細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因）蛋白水平降低。綜上所述，miR-590-5p過表達(dá)可減輕HF模型小鼠的心肌肥厚和心功能障礙。
圖3. MiR-590-5p過表達(dá)可減輕HF模型小鼠的心肌肥厚和心功能障礙
維真客戶AAV心臟注射實例 03
The deubiquitinase UCHL1 regulates cardiac hypertrophy by stabilizing epidermal growth factor receptor
病理性心臟肥大可導(dǎo)致心力衰竭。研究證實在促心肌肥厚途徑中表皮生長因子受體（EGFR或ErbB1）是正調(diào)控因子，EGFR的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運(yùn)和激活主要受翻譯后修飾的調(diào)控，然而其具體調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。研究表明去泛素化酶UCHL1在心肌梗死后的心肌細(xì)胞中表達(dá)高度上調(diào)，但是人們對其在調(diào)節(jié)心肌肥厚和重構(gòu)中的作用知之甚少。
在本研究中，研究者通過功能缺失和功能獲得的方法并使用抑制劑，證實UCHL1在激動劑誘導(dǎo)的心肌肥厚細(xì)胞及衰竭心臟中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)UCHL1（AAV9，尾靜脈注射）可加速壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚，而下調(diào)UCHL1則可顯著改善由激動劑或壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚；同時闡明了UCHL1通過降低EGFR泛素化和降解正向調(diào)節(jié)心肌肥厚，全身給藥UCHL1抑制劑可顯著逆轉(zhuǎn)心肌肥厚和重構(gòu)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明UCHL1在心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，可作為肥厚治療的靶點(diǎn)。
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病毒產(chǎn)品
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rAAV9-CMV-UCHL1 & rAAV9-CMV-GFP
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實驗動物
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9周齡C57BL/6J小鼠
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注射方式
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尾靜脈注射
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注射量
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5*10E11vg
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病毒滴度
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1*10E13 - 3.5*10E13 vg/mL
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如圖4所示，利用AAV9載體在小鼠心臟中過表達(dá)UCHL1，熒光顯微鏡檢測顯示心臟細(xì)胞得到高效感染，免疫印跡分析顯示心臟中UCHL1蛋白水平大大提高。
圖4. AAV9在小鼠心臟內(nèi)高效傳遞
與rAAV9-GFP對照組相比，UCHL1的過表達(dá)導(dǎo)致TAC術(shù)后小鼠發(fā)生更嚴(yán)重的心功能障礙，且死亡率明顯增加。此外在UCHL1表達(dá)增加的同時，EGFR蛋白水平、小鼠心肌中磷酸化的EGFR、AKT和ERK1/2（促心肌肥厚因子）也顯著升高，表明心臟中過表達(dá)UCHL1可加重心肌肥厚，并可能與EGFR的穩(wěn)定性有關(guān)（圖5）。
圖5. 過表達(dá)UCHL1可加速TAC術(shù)后小鼠的心肌肥厚
維真客戶AAV心臟注射實例 04
Oleic Acid Attenuates Ang II (Angiotensin II)-Induced Cardiac Remodeling by Inhibiting FGF23 (Fibroblast Growth Factor 23) Expression in Mice
高血壓可損傷多種靶器官，研究表明在輕度至中度高血壓人群中左心室肥厚（LVH）患病率為20%至50%。然而，高血壓心臟重構(gòu)的病理機(jī)制仍知之甚少。油酸（OA）是一種重要的單不飽和脂肪酸，據(jù)報道富含OA的地中海飲食可降低心血管在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生率，但其在高血壓性心臟重塑中的作用及機(jī)制尚不清楚。
本研究中作者對OA在高血壓性心臟重塑中的作用進(jìn)行了探討。通過檢測伴有和不伴有LVH高血壓患者的血漿代謝譜，研究人員發(fā)現(xiàn)伴LVH高血壓患者的外周血中OA水平顯著降低，并先后通過體外及體內(nèi)研究證實OA可顯著降低Ang II(血管緊張素II)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞生長、心肌成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)和小鼠心臟重塑。RNA測序進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FGF23(成纖維細(xì)胞生長因子23)在Ang II誘導(dǎo)反應(yīng)中表達(dá)顯著上調(diào)，而在OA處理后表達(dá)明顯受抑。利用AAV9載體過表達(dá)FGF23可加重Ang II誘導(dǎo)的心臟重塑，并削弱OA對心臟重塑的保護(hù)作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)OA通過阻斷Nurr1(核受體相關(guān)蛋白)從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的易位抑制Ang II誘導(dǎo)的FGF23表達(dá)，深入揭示了OA在防止Ang II誘導(dǎo)的心臟重塑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
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病毒產(chǎn)品
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AAV9-FGF23 & AAV9-GFP
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實驗動物
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10周齡C57BL/6雄性小鼠
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注射方式
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尾靜脈注射
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注射量
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150μl；5*10E11VG/ml（稀釋后）
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病毒滴度
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5.94*10E13VG/ml & 1.5*10E14VG/ml
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通過尾靜脈注射將AAV9-FGF23及AAV9-GFP載體注入小鼠體內(nèi)，熒光顯微鏡及WB檢測顯示AAV9病毒高效傳遞至小鼠心臟，F(xiàn)GF23蛋白在心臟組織中成功過表達(dá)（圖6）。FGF23在心臟組織中的過表達(dá)加重了Ang II誘導(dǎo)的心功能障礙，并損害了OA對心臟重構(gòu)及心肌纖維化的保護(hù)作用。
圖5. 過表達(dá)UCHL1可加速TAC術(shù)后小鼠的心肌肥厚
圖6. AAV9注射3周后小鼠心臟組織熒光結(jié)果及FGF23蛋白水平檢測
維真客戶AAV心臟注射實例 05
Redd1 protects against post?infarction cardiac dysfunction by targeting apoptosis and autophagy
心肌梗死（MI）是全球發(fā)病率和死亡率最高的心臟疾病之一，梗死后會發(fā)生心肌重塑并可能導(dǎo)致心力衰竭。目前，藥物干預(yù)仍是預(yù)防梗死后心臟重塑和功能障礙的有效治療方法，因此，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)，減輕心肌梗死后心臟重構(gòu)，從而防止梗死后患者心力衰竭的發(fā)展是至關(guān)重要的。據(jù)報道，細(xì)胞凋亡和自噬參與心肌組織發(fā)生的生理過程，而且哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)被證實在許多心臟病中可同時調(diào)節(jié)凋亡和自噬相關(guān)的發(fā)病機(jī)制，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。發(fā)育及DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)基因1（Redd1）參與mTOR活性調(diào)節(jié)，但其在心臟中的作用知之甚少。
在本研究中，作者首先檢測了MI小鼠心臟中Redd1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Redd1表達(dá)量下調(diào)。進(jìn)一步使用AAV9介導(dǎo)Redd1過表達(dá)發(fā)現(xiàn)Redd1的過表達(dá)改善了小鼠左心室功能障礙，降低了擴(kuò)張指數(shù)，并抑制了心肌細(xì)胞凋亡及改善了自噬。此外，研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Redd1可以抑制mTOR及其下游效應(yīng)蛋白的磷酸化，進(jìn)而緩解缺血損傷引起的心室功能障礙。綜上所述，本研究證明Redd1過表達(dá)通過mTOR信號通路減少細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)自噬來保護(hù)心肌梗死后心力衰竭的發(fā)生和持續(xù)，深入揭示了Redd1是心肌梗死后心力衰竭發(fā)展的治療靶點(diǎn)。
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病毒產(chǎn)品
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AAV9-Redd1 & AAV9-GFP
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實驗動物
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4-5周齡C57BL/6雄性小鼠
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注射方式
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尾靜脈注射
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注射量
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2.8*10E11VG/mice
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研究人員通過尾靜脈注射AAV9載體上調(diào)Redd1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)小鼠心肌細(xì)胞中Redd1表達(dá)量顯著上升。Redd1的過表達(dá)顯著降低了LVEDd和LVESd，大大提高了LVEF 和LVFS水平，并使ANP和BNP mRNA水平大幅下降，同時β-MHC mRNA水平也略有下降?？偟膩碚f，Redd1過表達(dá)在心肌梗死后對心功能障礙和心臟擴(kuò)張有保護(hù)作用。
圖7. Redd1過表達(dá)可預(yù)防心肌梗死后心功能不全
維真客戶AAV心臟注射實例 06
Downregulation of miR-146a Contributes to Cardiac Dysfunction Induced by the Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib
舒尼替尼（SNT）等酪氨酸激酶抑制劑可以顯著提高癌癥患者的預(yù)期壽命，但是這些藥物的使用可能會引發(fā)心臟收縮功能障礙、高血壓、慢性心力衰竭等心血管方面的不良反應(yīng)。然而，這種作用的分子機(jī)制仍然不清楚。MicroRNA是心血管疾病和酪氨酸激酶途徑中的關(guān)鍵調(diào)控因子，已被證實在心血管疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MicroRNA的過表達(dá)和下調(diào)可能是治療心臟病患者的一種有效方法。
研究人員使用miRNA芯片分析了舒尼替尼處理后小鼠心肌中miRNA的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-146a顯著下調(diào)。利用熒光素酶報告基因檢測實驗證實miR-146a的下游靶點(diǎn)為Pln和Ank2，二者與心臟收縮功能障礙密切相關(guān)。體內(nèi)外實驗結(jié)果表明SNT下調(diào)miR-146a的表達(dá)，并通過調(diào)控下游靶點(diǎn)PLN和ANK2導(dǎo)致心臟收縮功能障礙，上調(diào)miR-146a可緩解SNT對心臟收縮力的抑制作用。本研究揭示了miR-146a可能是一種有效的SNT誘導(dǎo)的心臟功能障礙的保護(hù)劑。
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病毒產(chǎn)品
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AAV9-cTNT-GFP-miR-146a & AAV9-Control
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實驗動物
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C57雄性小鼠（20-25g）
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注射方式
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尾靜脈注射
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病毒滴度
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1*10E11VP
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如圖8所示，研究人員使用心臟特異性啟動子cTNT驅(qū)動的AAV9載體在小鼠心臟特異表達(dá)miR-146a，不同組織的熒光圖像表明，靜脈注射病毒載體后僅心臟被高效感染。通過超聲心動圖檢測心臟收縮功能，結(jié)果表明心臟中miR-146a的過表達(dá)顯著抑制了SNT誘導(dǎo)的EF和FS降低，表明心臟功能得到改善。
圖8. 體內(nèi)過表達(dá)miR-146a可減輕SNT誘導(dǎo)的心肌收縮功能障礙
