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研究背景
自噬是細胞中高度保守的生物學現(xiàn)象，能在脂代謝過程中扮演著重要角色。Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶（PI3KC3）在自噬過程中發(fā)揮著重要功能。作為PI3KC3的亞基之一，Pacer在提高PI3KC3激酶活性和自噬水平方面均能起到重要的作用，Pacer是浙大孫啟明課題組新近鑒定的一個脊椎動物特有的自噬調控分子，相關工作已于2017年發(fā)表在了Mol Cell雜志上。最近的研究顯示，Pacer存在磷酸化和乙?；男揎?，本研究旨在研究Pacer對肝臟脂質水平以及自噬發(fā)展的影響。
研究思路
首先，研究者利用腺相關病毒實現(xiàn)Pacer及其突變體在肝臟組織中的表達，分析Pacer磷酸化對小鼠肝臟自噬水平的影響；其次，通過建立非酒精性脂肪肝的小鼠模型，并在建模成功后將Pacer的多種乙?；蛔凅w病毒注射至小鼠體內，觀察肝臟的脂質水平以及自噬發(fā)展的水平。
部分研究成果
1. Pacer磷酸化對小鼠肝臟自噬水平的影響
研究人員采用腺相關病毒腹腔注射的方法，將 AAV-Pacer WT以及Pacer的多種變異體（PacerS157A和Pacer S157D）注射至小鼠體內，并在注射后21天處死小鼠，分析肝臟細胞，檢測自噬水平的變化。結果如圖1所示：Western blot分析可見，肝臟組織經(jīng)腺相關病毒感染后，Pacer WT, Pacer S157A和Pacer S157D的表達水平顯著增加。
圖1. 腺相關病毒介導的Pacer磷酸化變體在肝臟組織中的表達水平及其對自噬基因表達的影響
2. Pacer磷酸化對自噬溶酶體形成的影響
結果如圖2所示，采用腺相關病毒介導的Pacer磷酸化變體補救Pacer敲降的U2OS細胞，可見過表達Pacer S157A的去磷酸化變體可顯著促進自噬溶酶體的形成，而Pacer S157D的永久磷酸化變體則無法促進自噬溶酶體的形成。
圖2. 免疫熒光分析腺相關病毒介導的Pacer磷酸化變體對自噬溶酶體形成的影響
3. Pacer乙?；瘜Ω闻K組織自噬水平的影響
非酒精性脂肪肝建模成功后，采用維真腺相關病毒在肝臟組織過表達Pacer WT和Pacer 2KR變體，結果如圖3所示：可見腺相關病毒介導Pacer及其變體可在肝臟組織中表達。
圖3. Western blot分析腺相關病毒介導的Pacer乙酰化變體在肝臟組織中的表達情況
4. Pacer乙?；瘜Ω闻K脂質代謝的影響
結果如圖4所示，采用高脂飼料喂養(yǎng)建模后采用油紅染色和電鏡分析，顯示肝臟組織和細胞中脂質水平顯著增加。而采用腺相關病毒介導Pacer WT可顯著降低肝臟組織中脂質水平，腺相關病毒介導Pacer 2KR（乙?；凅w）則無法有效降低肝臟中脂質水平。
圖4. 油紅染色電子顯微鏡分析肝臟組織中脂質水平的變化
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文章小結：該工作闡明了脊椎生物特有的自噬調控基因Pacer如何感知上游營養(yǎng)信號，進而調控自噬體成熟和肝臟脂代謝的分子機制。這項工作不僅確定了Pacer蛋白是肝臟自噬和肝臟穩(wěn)態(tài)的調控者，而且還揭示了肝臟自噬的后期和脂質代謝中的信號整合機制?！禡olecular Cell》（IF:14.248）
病毒產(chǎn)品及使用方法
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產(chǎn)品名稱 |
血清型 |
購自 |
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AAV-mCherry-GFP-LC3 |
AAV9 |
維真生物 |
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AAV-Vector |
AAV9 |
維真生物 |
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AAV-PacerWT-HA |
AAV9 |
維真生物 |
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AAV-PacerS157A |
AAV9 |
維真生物 |
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AAV-PacerS157D-HA |
AAV9 |
維真生物 |
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AAV-Pacer2KR-HA |
AAV9 |
維真生物 |
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病毒用量：1×10E11 cfu/只； 注射方法：腹腔注射； |
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