『糖尿病治療新靶點(diǎn)』南京大學(xué)韓曉教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)HRD1——T2D治療新靶點(diǎn)！
無標(biāo)題文檔
背景介紹
糖尿?。╠iabetes） 是一種以葡萄糖和脂肪代謝紊亂、血漿葡萄糖水平升高為主要臨床特點(diǎn)的代謝性疾病，長期的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。糖尿病主要分為四類：1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和特殊類型糖尿病，以2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）最為常見。 1型或2型糖尿病均存在明顯的遺傳異質(zhì)性。1型糖尿病有多個DNA位點(diǎn)參與發(fā)病，其中以HLA抗原基因中DQ位點(diǎn)多態(tài)性關(guān)系最為密切。2型糖尿病已發(fā)現(xiàn)多種明確的基因突變，如胰島素基因、胰島素受體基因、葡萄糖激酶基因、線粒體基因等。
2020年，南京醫(yī)科大學(xué)韓曉教授研究團(tuán)隊(duì) 在《Diabetes 》上發(fā)表的“HRD1 an important player in pancreatic β-cell failure and therapeutic target for type 2 diabetic mice”論文研究表明胰島β細(xì)胞中HRD1的特異性過表達(dá)引發(fā)胰島素分泌受損，最終導(dǎo)致嚴(yán)重高血糖。該研究成果發(fā)現(xiàn)HRD1可作為2型糖尿病的治療靶點(diǎn)，使人類在治療T2D方面又取得新進(jìn)展！
HRD1 (HMG-CoA reductase degradation 1)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)E3泛素連接酶的代表，通過靶向并有效降解錯誤折疊的胰島素原維持胰島β細(xì)胞的功能，HRD1的缺失會導(dǎo)致胰島素分泌（GSIS）受損。研究報(bào)道HRD1在 Akita糖尿病小鼠胰島中表達(dá)上調(diào)。NCBI GEO數(shù)據(jù)庫的基因組數(shù)據(jù)顯示，T2D患者胰島細(xì)胞HRD1 mRNA水平升高。然而，HRD1在胰島β細(xì)胞中的特異性病理作用仍不明確。
研究結(jié)果分享
1.糖尿病人及小鼠胰腺β細(xì)胞HRD1表達(dá)升高
通過Western blot、qRT-PCR和免疫熒光染色方法，作者發(fā)現(xiàn)：① db/db和HFD飼料喂養(yǎng)的糖尿病小鼠胰島中HRD1顯著上調(diào)；② T2D患者分離的胰島也得到了類似的結(jié)果；③db/db和HFD飼喂的小鼠胰腺β細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)HRD1顯著升高，伴隨胰島素水平的顯著降低；④ 長期暴露于高糖環(huán)境的人及小鼠胰島細(xì)胞HRD1表達(dá)較正常組明顯上調(diào)；⑤ 在慢性高糖處理的人胰島初級β細(xì)胞中HRD1表達(dá)增強(qiáng)。綜上所述，糖尿病人及小鼠胰腺β細(xì)胞HRD1表達(dá)水平升高，可能與β細(xì)胞的衰竭和糖尿病的發(fā)生有關(guān)。
圖1. HRD1在糖尿病人及小鼠胰島β細(xì)胞中表達(dá)升高
2.
抑制HRD1改善糖尿病小鼠的血糖控制和血糖反應(yīng)
作者將AAV-MIP-shHRD1-GFP（維真生物提供） 注射入雄性C57BL / 6J小鼠胰腺導(dǎo)管，特異性敲低小鼠β細(xì)胞中的HRD1。免疫熒光觀察顯示AAV病毒在體內(nèi)有效傳遞。
隨后作者將AAV8-MIP-shHRD1（維真生物提供） 注射入HFD飼喂的糖尿病小鼠胰腺導(dǎo)管，2周后，糖尿病小鼠空腹血糖明顯下降。4周后，糖耐量試驗(yàn)（Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT）結(jié)果顯示糖尿病小鼠血糖反應(yīng)和血清胰島素水平明顯改善。AAV-shHRD1注射db/db小鼠的葡萄糖反應(yīng)也有改善。綜上結(jié)果表明HRD1在胰島β細(xì)胞功能障礙和糖尿病中發(fā)揮重要作用。
圖2. 抑制HRD1可改善糖尿病小鼠高血糖和葡萄糖耐受不良
3.
HRD1過表達(dá)致胰島素分泌受損和血糖升高
作者胰腺導(dǎo)管內(nèi)注射AAV8-MIP-HRD1（維真生物提供） ，注射后胰島HRD1蛋白水平明顯升高，小鼠的空腹血糖和復(fù)餐血糖水平顯著升高，獲得β細(xì)胞HRD1特異性過表達(dá)小鼠。IPGTT結(jié)果顯示糖代謝嚴(yán)重受損，HRD1特異性過表達(dá)的小鼠血漿胰島素水平表現(xiàn)紊亂。上述結(jié)果表明β細(xì)胞HRD1上調(diào)可誘發(fā)高血糖并損傷胰島素的分泌。
圖3. HRD1過表達(dá)引發(fā)高血糖和葡萄糖耐受不良
4.
HRD1和MafA在細(xì)胞中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)
為了確定HRD1高表達(dá)引起的β細(xì)胞胰島素分泌受損的分子基礎(chǔ)，作者通過質(zhì)譜分析研究Ad-HRD1 或 Ad-GFP感染后MIN6細(xì)胞HRD1的結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)其中一種蛋白細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子MafA與碳水化合物刺激反應(yīng)有關(guān)，免疫沉淀分析證實(shí)HRD1和MafA共存于沉淀復(fù)合物中，當(dāng)HRD1高表達(dá)時(shí)，HRD1和MafA的相互作用增強(qiáng)，在人胰島證實(shí)HRD1和MafA之間呈負(fù)相關(guān)。MafA是β細(xì)胞功能和健康的積極指標(biāo)，HRD1過表達(dá)在翻譯水平而非轉(zhuǎn)錄水平上顯著降低了MafA的表達(dá)。
圖4. HRD1和MafA直接相互作用，在細(xì)胞中表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)
免疫沉淀分析證實(shí)HRD1和MafA同時(shí)存在于沉淀復(fù)合物中，HRD1和MafA之間呈負(fù)相關(guān)作用，當(dāng)HRD1高表達(dá)時(shí)，二者的相互作用增強(qiáng)。此外，HRD1過表達(dá)在翻譯水平而非轉(zhuǎn)錄水平上顯著降低了MafA的表達(dá)。
5.
HRD1通過抑制MafA表達(dá)致胰島素分泌受損
作者研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)感染Ad-HRD1的小鼠胰島和MIN6細(xì)胞，胰島素分泌明顯被抑制，這種抑制可通過補(bǔ)充MafA得以恢復(fù)。敲除HRD1可有效減輕因暴露于慢性高糖環(huán)境而導(dǎo)致的小鼠胰島和MIN6細(xì)胞MafA的減少。小鼠胰島細(xì)胞和長期暴露高糖環(huán)境的MIN6細(xì)胞HRD1敲除后，葡萄糖或KCL刺激的胰島素分泌也得到了恢復(fù)。HFD飼喂的小鼠和db/db小鼠，AAV-shHRD1注射4周后，胰島MafA表達(dá)水平也出現(xiàn)反彈。綜上所述，HRD1高表達(dá)通過下調(diào)MafA使β細(xì)胞發(fā)生功能障礙。
圖5. HRD1高表達(dá)通過下調(diào)MafA導(dǎo)致胰島素分泌受損
6.
HRD1導(dǎo)致MafA在細(xì)胞質(zhì)積累，并削弱其核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性
在HRD1過表達(dá)時(shí)，在MIN6細(xì)胞及HEK293A細(xì)胞，MafA和HRD1定位于細(xì)胞核周圍而不是細(xì)胞核，主要在ER區(qū)域共定位，表明HRD1在ER附近捕捉MafA，通過其胞質(zhì)C端結(jié)構(gòu)域與胞質(zhì)MafA相互作用。熒光素酶報(bào)告基因檢測，作者發(fā)現(xiàn)HRD1過表達(dá)顯著降低MafA的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，qPCR和ChIP-qPCR結(jié)果證實(shí)胰島素是MafA調(diào)控的主要基因。HRD1的敲低部分挽救了糖脂毒性條件下核MafA的減少，表明HRD1的降低足以維持核MafA水平。HRD1不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)MafA的數(shù)量，而且調(diào)節(jié)其在β細(xì)胞中的定位。
圖6. HRD1誘導(dǎo)MafA細(xì)胞質(zhì)聚集，削弱其在細(xì)胞核中的功能
7.
HRD1作為E3泛素連接酶降解MafA
HRD1泛素連接酶的活性離不開其Ring環(huán)域內(nèi)的第291位半胱氨酸，作者測量了HRD1- WT及C291S突變體HRD1 (HRD1- C291S)對MafA泛素化的影響，發(fā)現(xiàn)HRD1- WT過表達(dá)顯著增加MafA泛素化；HRD1下調(diào)可顯著降低慢性高糖處理MIN6細(xì)胞MafA的泛素化，HRD1的缺失抑制高糖環(huán)境下MafA蛋白的快速降解，并恢復(fù)MIN6細(xì)胞總MafA蛋白的下降。上述結(jié)果表明HRD1是E3泛素連接酶，其作用是負(fù)責(zé)MafA的泛素化和降解。
圖7. HRD1靶向MafA進(jìn)行泛素化并將其降解
小結(jié)
本研究揭示HRD1作為E3泛素連接酶介導(dǎo)MafA的泛素化和降解，它的失調(diào)(缺失或過量)可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能衰竭，在糖尿病的發(fā)病機(jī)理中起著重要的作用。針對HRD1靶向治療可提高M(jìn)afA的蛋白水平，改善β細(xì)胞功能，治療2型糖尿病。
維真助力
產(chǎn)品： 滴度： 1012 GCP/ml 注射方式： 胰腺導(dǎo)管內(nèi)注射
參考文獻(xiàn)
1. Hu Y, Gao Y, Zhang M, Deng KY, Singh R, Tian Q, Gong Y, Pan Z, Liu Q, Boisclair YR,Long Q. 2019. Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD) Has a Critical Role in Supporting Glucose-Stimulated Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells. Diabetes 68: 733-46 .
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