肝臟是較早被用于基因治療的器官,現(xiàn)已明確許多肝病是由單基因缺陷引起,因此相比其他由多基因缺陷引起的復(fù)雜疾病更適合開展臨床基因治療。肝靶向基因治療面臨的挑戰(zhàn)在于肝細(xì)胞的有效靶向、載體基因組的穩(wěn)定性和持續(xù)的高水平表達(dá),rAAV載體的出現(xiàn)及使用使這一難題的解決成為可能。今天小V就帶大家一起學(xué)習(xí)一下rAAV在肝臟應(yīng)用中的相關(guān)選擇策略。
Vol.1
AAV血清型的選擇
在肝臟中應(yīng)用較多的有AAV2、AAV5、AAV8、AAV9及AAV-DJ等血清型,研究表明AAV8、AAV9和AAV-DJ對肝臟均具有較強(qiáng)的親嗜性,其中AAV8嗜肝性更強(qiáng),用于活體動物注射表現(xiàn)為免疫原性低,感染效率高,AAV-DJ的體內(nèi)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與AAV8相近,且在體外實(shí)驗(yàn)中也能表現(xiàn)出較強(qiáng)的感染效率。
研究者還可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募皠游锬P偷牟煌x擇不同的血清型,其中AAV7、AAV8對小鼠肝臟感染具有較好效果;而在人體肝臟中AAV2、AAV5和AAV8親和性較強(qiáng)。
如下圖所示:無論是選用門靜脈還是尾靜脈注射,AAV8均能有較高的肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)水平
種類 | AAV血清型推薦 |
---|---|
小鼠肝臟 | AAV7、AAV8 |
高等靈長類動物肝臟 | AAV2、AAV5、AAV8 |
Vol.2
啟動子的選擇
在肝臟中,廣譜型啟動子CMV即可高效表達(dá),也可以選擇肝臟特異啟動子增強(qiáng)組織靶向性,如ALB、TBG和ApoEHCR-hAAT,其中TBG應(yīng)用較多。
啟動子 | 啟動子 | 大小 |
---|---|---|
廣譜啟動子 | CMV(常用) | 600bp |
CAG | 944bp | |
特異性啟動子 | ALB(較大) | 2.4Kb |
TBG(常用) | 460bp | |
ApoEHCR-hAAT | 1.3Kb |
Vol.3
常用的肝臟注射方式
肝臟對全身應(yīng)用AAV有較高的親合性,AAV在肝臟中的注射方式分為直接傳送和外周傳送兩種(下表所示),其中尾靜脈注射和腹腔注射是目前應(yīng)用比較廣泛的注射方式,操作者也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的注射方式。
注射方式 | 覆蓋 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
---|---|---|---|
直接傳送 | 肝葉注射、門靜脈注射、脾包膜注射;肝動脈注射(大動物與人); | 克服了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的問題,靶向性高,所需病毒量少; | 侵入性強(qiáng),風(fēng)險(xiǎn)大,實(shí)驗(yàn)操作技能要求高; |
外周傳送 | 腹腔注射和靜脈注射(尾靜脈注射和眶后靜脈竇注射等); | 操作簡單,無須手術(shù)或麻醉; | 靶向性較直接傳送稍差,可能需要較多的注射體積; |
在此,我們介紹一下幾種常用的注射方式,肝門靜脈注射、肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注射、尾靜脈注射以及新生小鼠靜脈注射的操作步驟供大家參考。
1. 肝門靜脈注射
(1)通過腹腔注射麻醉劑將成年小鼠麻醉,對小鼠腹部局部區(qū)域做去毛及消毒處理;
(2)在距劍突軟骨下方2-3mm處,做一個(gè)2-3cm的中線切口。
(3)暴露門靜脈,使用30G針頭在1min內(nèi)均勻緩慢注射0.2 ml病毒懸液。
注:門靜脈是一種相對較大的靜脈,提起肝前葉一般即可看到門靜脈。在手術(shù)過程中,用浸泡在生理鹽水中的無菌紗布覆蓋腸道,保持腸道濕潤。
(4)注射后保持針位約10-20秒。取出針后,做好防出血處理;
(5)縫合腹部,將小鼠放置于加熱燈下,直至恢復(fù)意識。然后將其放回籠子單獨(dú)飼養(yǎng),直到傷口完全愈合。
2. 肝內(nèi)注射
(1)通過腹腔注射麻醉劑將成年小鼠麻醉,對小鼠腹部局部區(qū)域做去毛及消毒處理;
(2)在距劍突軟骨下方2-3mm,做一個(gè)2-3cm的中線切口,以露出肝臟。
(3)用固定在結(jié)核菌素注射器上的30G針頭將病毒懸液緩慢注入肝實(shí)質(zhì)中。
注:在注射過程中通過手術(shù)立體鏡監(jiān)測注射部位,確保無出血或外滲。如果出現(xiàn)上述任何一種情況,需取出針頭,輕輕按壓止血,然后選擇一個(gè)新的部位進(jìn)行注射。
(4)取出針,用無菌紗布輕輕按壓止血。
(5)再選擇其他部位進(jìn)行注射。
注:一只成年小鼠一次可選擇4 ~ 5個(gè)不同的注射位點(diǎn)(40 ~ 50μl/site),總劑量可達(dá)200μl。
(6)縫合腹部,將小鼠放置于加熱燈下,直至恢復(fù)意識。然后將其放回籠子單獨(dú)飼養(yǎng),直到傷口完全愈合。
3. 尾靜脈注射
(1)將小鼠放在標(biāo)準(zhǔn)限制器中,使注射器能夠完全接觸到整個(gè)尾巴長度。
(2)將一根30G的針頭固定在1cc結(jié)核菌素注射器上,盡可能遠(yuǎn)的插入尾部側(cè)面靜脈。選擇一個(gè)遠(yuǎn)端部位,如果第一次注射失敗,可以選擇另一個(gè)更近端的注射部位。
注:a:小鼠尾巴上較容易接觸到的靜脈位于尾巴的側(cè)面,且側(cè)靜脈非常淺,無需進(jìn)針很深;小鼠尾部背面的靜脈很難常規(guī)注射;尾部腹面的血管是動脈,不可注射。
b:注射前用溫水輕輕地加熱尾巴,可以使血管得到一定程度的舒張,便于注射。
(3)針頭到位后,緩慢注射病毒懸液。
(4)注射完成后取下針頭,輕輕按壓止血,然后立即將小鼠放回籠中。
注:使用此方法注射成年小鼠,病毒用量控制在300 - 400μl較佳。
4. 新生小鼠靜脈注射
(1)需兩個(gè)人配合完成,一人固定,一人注射;
(2)注射前將小鼠置于干毛巾上,減少活動及損傷;
(3)一人輕輕固定小鼠,使側(cè)面朝上,暴露眼睛至頸部的顳淺靜脈,置于放大鏡下;
(4)另一人沿著自頭至頸的方向?qū)?/span>30G的注射針頭插入靜脈旁的皮下,慢慢推進(jìn)靜脈(新生鼠皮膚呈現(xiàn)半透明,較易觀察);
(5)慢慢注射病毒懸液;(如果注射成功,注射部位遠(yuǎn)端靜脈會呈白色,如果未成功,皮下注射10μl即可看到明顯的隆起)
(6)注射完成后,取下針頭,輕輕按壓靜脈,通常2-3分鐘會停止出血;
(7)將新生鼠在加熱燈下照射后,放回母鼠身邊;
(8)如果注射不成功,讓小鼠恢復(fù)5-10分鐘,然后在另一側(cè)嘗試第二次注射;
注:使用此方法注射新生小鼠,病毒用量控制在100μl以內(nèi)較佳。
Vol.4
總結(jié)
在應(yīng)用AAV進(jìn)行肝臟研究時(shí),可以選擇靶向性更強(qiáng)的肝門靜脈注射或肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注射方式,如果實(shí)驗(yàn)技能受限或減少侵入性損傷,也可以選擇尾靜脈注射等實(shí)驗(yàn)技能要求稍低的給藥策略,在這種情況下,就可以配合AAV8等肝臟嗜性較強(qiáng)的血清型以及TBG等肝臟特異性啟動子提高AAV對肝臟的感染效率,以達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果。
Vol.5
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AAV在肝臟研究中的靶向策略【應(yīng)用篇】(可點(diǎn)擊查看)