『干貨篇』AAV在肺部應用中的靶向策略
重組腺相關病毒(rAAV)作為一種靶向性高和安全性好的病毒載體，被廣泛用于基因的傳遞和表達，也被認定為未來非常有前景的基因治療載體。早在上世紀90年代科學家就選擇肺作為靶向?qū)嶒炂鞴伲胷AAV進行肺部疾病的臨床研究。眾所周知，rAAV的轉(zhuǎn)導效率與AAV血清型及給藥途徑等因素息息相關，今天小V就帶大家一起學習一下在肺部應用中有關AAV血清型、啟動子及給藥途徑的選擇策略。
一、AAV血清型的選擇
目前研究人員已發(fā)現(xiàn)12種人類AAV血清型（AAV1至AAV12）和100多種非人類靈長動物AAV血清型。其中，多種AAV血清型可不同程度地誘導目的基因在肺部的表達，比如AAV2、AAV5、AAV6及AAV9等。其中，AAV6由于可以有效地介導基因在氣道和肺泡II型細胞的表達，而氣道和肺泡II型細胞通常是肺部疾病基因治療的靶細胞群體，因此被認為是用于肺部基因轉(zhuǎn)移的一種理想AAV血清型。
下圖所列為AAV2、AAV5、AAV6及AAV9四種血清型對肺部的感染情況：
研究表明，針對肺部感染rAAV在血清型上的選擇根據(jù)動物模型的不同而存在差異，主要體現(xiàn)在小鼠及較低等靈長類動物與高等靈長類動物之間。在小鼠及一些較低等的靈長類動物中，AAV5及AAV6是感染肺部的理想選擇；針對高等靈長類動物，AAV1對肺部的感染效率更高；在肺癌的研究中，我們通常推薦AAV2血清型。
種類
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AAV血清型推薦
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小鼠與低等靈長類動物肺部
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AAV5/AAV6
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高等靈長類動物肺部
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AAV1
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肺癌
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AAV2
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2020年牛津大學Helena Meyer-Berg等研究者通過建立肺芽樣器官( lung bud organoids，LBOs)模型——一種由人胚胎干細胞(hESCs)生成的人肺實質(zhì)模型，用于篩選病毒載體轉(zhuǎn)導，進而確定適合于人肺實質(zhì)轉(zhuǎn)導的血清型。研究證實在所用的八種AAV血清型中，rAAV2和rAAV6以及rAAV6變體（rAAV6.2和rAAV6.2FF），對人肺實質(zhì)親和性較強。
不同AAV血清型對人肺實質(zhì)的轉(zhuǎn)導效率比較
（Meyer-Berg, H., et al. Stem Cell Res Ther, 2020.）
二、啟動子的選擇
根據(jù)不同的注射方式和實驗目的，可選擇不同的啟動子以提高AAV在肺部的表達效率。如下圖所示，CMV在啟動真核基因表達方面具有極高的效率，可高效感染小鼠肺部；CAG同樣具有出色的感染氣道的能力。此外，如果要感染肺臟中特定類型的細胞，還可以考慮選擇細胞特異性的啟動子，如內(nèi)皮細胞啟動子ICAM2或者平滑肌細胞啟動子SM22α，可實現(xiàn)對內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞的特異性感染。
三、常用的肺部注射方式
AAV感染肺部的方法有多種，較為常用的方法有鼻內(nèi)滴注法、氣管插管術、氣管內(nèi)注射，如果對肺部感染AAV的特異性要求較低，也可采用靜脈注射、腹腔注射等方法，當進行肺癌成瘤實驗時，也可采用瘤內(nèi)注射的方式。下面對AAV感染肺部常用的三種方法進行介紹。
1、鼻內(nèi)滴注法
鼻內(nèi)滴注法是一種直接的AAV感染法，操作簡單且對設備要求低，對新手實驗員也同樣適用。缺點是AAV顆粒容易沉積在上呼吸道（鼻道、鼻竇和咽）和胃腸道，如果需要有效地感染到下呼吸道，則可能需要更大劑量的AAV才能實現(xiàn)。
鼻內(nèi)滴注AAV（兩種操作手法）
（van Lieshout., et al. Methods Mol Biol, 2019.
Santry, L.A., et al.BMC Biotechnol, 2017.）
操作步驟
①腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
注意：為了保持小鼠穩(wěn)定的呼吸頻率，不應過度麻醉。
②甲按上圖所示兩種方法將小鼠控制好，防止其用嘴呼吸；
③乙緩慢滴一滴AAV懸液于小鼠鼻孔內(nèi)壁，待液體被吸入后再滴下一滴，重復此操作至40μL AAV懸液全部滴完；
④使小鼠保持上述姿勢約30~60s，以便AAV懸液充分進入下呼吸道；
⑤待小鼠在籠中恢復10min后，重復上述操作，再次給藥40μL（每只小鼠共給藥80μL）；
⑥將小鼠放回籠中直至完全清醒。
2、氣管插管術
口腔氣管插管術能夠?qū)⒉《据d體直接灌輸入肺中，卻沒有外科手術的風險，并且避免了上呼吸道的病毒顆粒的損失。由于幾乎所有AAV病毒顆粒都會到達肺內(nèi)，所以要嚴格控制AAV的使用量。同時，與鼻內(nèi)滴注法相比，口腔氣管插管術需要一些特殊設備，操作起來也稍有難度。
氣管插管術注射AAV
（Das, S., et al. J Vis Exp, 2013.）
操作步驟
①腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
注意：動物必須處于足夠深的麻醉狀態(tài)以防止運動或?qū)d體的反應而打噴嚏或咳嗽；
②將小鼠放在垂直支架上，將門牙環(huán)置于小鼠上門牙上，讓老鼠的腹部面向自己；
③輕輕地把小鼠舌頭拉出來，并用拇指和食指按住，中指放在小鼠頸部和塑料支架之間；
④用食指、拇指在小鼠舌上牽引令其嘴張開，使插管路徑伸直，并用中指在頸后調(diào)整頭部角度；
⑤利用光纖作為光源和引導者，推動它通過可視聲帶（如果看不到聲帶，用中指作支撐，輕輕用力拉舌）；
⑥光纖插入后，同時將導管向前推進約5mm，然后勿移動導管，取出光纖；
⑦使小鼠平躺，用膠帶將導管固定在小鼠嘴部防止其移動，另一端用橡皮泥支撐；
⑧用注射器通過導管輸入80μL AAV；
注意：在抽取80μL載體之前，吸取約100μL的空氣至移液管尖，以防止載體的丟失，并促進載體深入肺部。
⑨等待5min，使AAV充分進入下呼吸道；
⑩把導管移出，將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
?將小鼠放回籠中直至完全清醒。
3、氣管內(nèi)注射
與鼻內(nèi)滴注相比，氣管內(nèi)注射能夠提高AAV進入肺部的效率；與口腔氣管插管法相比，設備更簡單，操作更容易。然而，氣管內(nèi)注射具有極高的外科手術風險，包括出血、切口開裂、感染以及較長的恢復期等。不僅如此，由于小鼠氣管窄小，很容易出現(xiàn)操作失誤，將AAV注射到氣管周圍組織或食管中去。
氣管內(nèi)注射AAV
（van Lieshout., et al. Methods Mol Biol, 2019. ）
操作步驟
①腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
②將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上，并將其前爪伸直固定；
③剃除頸部部分區(qū)域的鼠毛，并用碘伏做消毒處理；
④用手術剪刀在頸部做一個5~7mm的小切口；
⑤手握鑷子固定住小鼠氣管，另一只手握住注射器，使注射器針頭斜面朝上，與氣管成45°。
注意：一旦針頭插入，輕輕地將針頭向外移動，遠離小鼠身體，確定針頭是否正確地插入氣管。
⑥將40~80μL 的AAV緩慢注入氣管，等待5s后慢慢取出針管；
⑦縫合傷口，將小鼠放回籠中恢復，直到完全清醒。
三種AAV肺部給藥途徑的比較：
總結(jié)：AAV載體給藥方式應根據(jù)研究人員的目標位點和技能進行選擇。
本篇暫為大家分享如上內(nèi)容，希望對大家的實驗開展有所幫助，下期，小V將從客戶的實際應用效果出發(fā)，為您獻上AAV在肺部應用中的靶向策略之應用篇，我們共同學習！
文獻參考：
[1]. Meyer-Berg, H., et al., Identification of AAV serotypes for lung gene therapy in human embryonic stem cell-derived lung organoids. Stem Cell Res Ther, 2020. 11(1): p. 448.
[2]. van Lieshout, L.P., J.M. Domm and S.K. Wootton, AAV-Mediated Gene Delivery to the Lung. Methods Mol Biol, 2019. 1950: p. 361-372.
[3]. Santry, L.A., et al., AAV vector distribution in the mouse respiratory tract following four different methods of administration. BMC Biotechnol, 2017. 17(1): p. 43.
[4]. Das, S., et al., A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp, 2013(73): p. e50318.
AAV在肺部應用中的靶向策略『應用篇』（可點擊查看）
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