干貨篇｜AAV在肌肉組織中的靶向應(yīng)用策略
肌肉是人體的重要組成部分，不僅是多種肌營(yíng)養(yǎng)不良疾病基因治療的靶組織，還可作為生產(chǎn)和分泌治療遠(yuǎn)端器官疾病功能蛋白的生物工廠，肌肉組織的這些特征使其成為開發(fā)基因治療策略的通用平臺(tái)，用于遞送相關(guān)疾病功能基因。AAV載體是將基因轉(zhuǎn)移到骨骼肌和心肌等肌肉組織的理想載體，經(jīng)AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)后肌肉細(xì)胞可以表達(dá)功能性重組蛋白，并將這些蛋白分泌到血液中進(jìn)行全身遞送，通過這種策略用于糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、血友病及癌癥等的疾病治療，目前由AAV介導(dǎo)的肌肉基因治療已逐步邁入臨床。本期我們整理了AAV在肌肉組織的靶向策略以及部分案例，希望對(duì)大家的研究有所幫助。
一、啟動(dòng)子的選擇
在肌肉組織的研究中，除了可以選擇CMV和CAG等常用的廣譜啟動(dòng)子，還可選擇肌肉特異性啟動(dòng)子MCK，以實(shí)現(xiàn)基因在肌肉中高效和特異性的表達(dá)。
維真生物肌肉組織特異性啟動(dòng)子可供選擇：
二、AAV血清型的選擇
根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，AAV1、2、6、7、8和9均可有效轉(zhuǎn)導(dǎo)肌肉組織，但若要實(shí)現(xiàn)基因在肌肉組織的更高特異性地表達(dá)，通常是建議結(jié)合合適的血清型、肌肉特異性啟動(dòng)子以及適當(dāng)?shù)慕o藥方式來實(shí)現(xiàn)。
1、AAV9結(jié)合CK6啟動(dòng)子，通過頸靜脈注射的方式可高效、選擇性的將基因傳遞到骨骼肌。
AAV9結(jié)合CK6啟動(dòng)子經(jīng)頸靜脈注射后高效靶向缺血性骨骼肌
（Katwal AB, et al. Gene Ther. 2013）
2、AAV1和AAV6均可有效靶向橫紋肌，由于AAV6與肝素有較好的親和力，與AAV1相比，無論是通過肌肉注射還是靜脈注射，AAV6都能以更高的效率持續(xù)轉(zhuǎn)導(dǎo)橫紋肌。
相比AAV1，AAV6經(jīng)肌肉注射后有效靶向橫紋肌
相比AAV1，AAV6經(jīng)靜脈注射后有效靶向橫紋肌
（Arnett AL, et al.Gene Ther.2013）
3、來自美國(guó)布羅德研究所和哈佛大學(xué)等研究機(jī)構(gòu)的研究人員在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)定向進(jìn)化出一種工程化改造的AAV載體— MyoAAV，研究顯示這種載體能夠高效靶向肌肉組織，遞送到肌肉組織的效率是傳統(tǒng)病毒載體的10倍以上。同時(shí)，與傳統(tǒng)遞送載體相比，該載體在遺傳性肌肉疾病中的治療劑量降低大約100到250倍，可有效降低肝臟損傷和其他嚴(yán)重副作用的風(fēng)險(xiǎn)。
全身給藥后，MyoAAV 1A可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠骨骼肌
（Mohammadsharif Tabebordbar，et al.Cell.2021）
三、AAV給藥途徑的選擇
載體給藥途徑可以影響AAV在體內(nèi)的組織趨向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。多種AAV給藥途徑可以實(shí)現(xiàn)局部或全身的肌肉基因轉(zhuǎn)移，以達(dá)到不同的治療目的，如肌肉注射、逆行經(jīng)靜脈肢體灌注、冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注、再循環(huán)給藥、腹腔注射和靜脈給藥，以及針對(duì)特定器官的方法比如心包內(nèi)注射和心內(nèi)膜注射等。
其中，肌肉注射簡(jiǎn)單方便，可以將載體輸送到目標(biāo)肌肉群，小鼠肌肉注射的常見部位包括脛骨前肌、腓腸肌和股四頭??；逆行經(jīng)靜脈肢體灌注針對(duì)更多的肌肉群，更加適合治療影響大肌肉群的疾??；心包內(nèi)注射通常用于新生動(dòng)物，可同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)心臟和隔膜；心內(nèi)膜注射在犬和NHP模型中可實(shí)現(xiàn)心臟基因的整體遞送；冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注將治療基因傳遞到心臟已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)；腹腔注射和靜脈給藥可實(shí)現(xiàn)全身的肌肉基因轉(zhuǎn)移，但易產(chǎn)生脫靶和免疫毒性。
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肌肉注射、逆行經(jīng)靜脈肢體灌注、冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注、心包內(nèi)注射、心內(nèi)膜注射、再循環(huán)給藥
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轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高；
靶向性強(qiáng)；
低免疫反應(yīng)；
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廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)大肌肉群乃至全身肌肉
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高劑量載體需求易產(chǎn)生脫靶和免疫毒性；AAV血清型有限
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下面簡(jiǎn)述肌肉注射方式的操作步驟：
1、對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，腹腔注射甲苯噻嗪/氯胺酮混合液將小鼠麻醉；
2、對(duì)小鼠右脛前肌進(jìn)行刮毛及消毒處理；
3、使用適當(dāng)大小的注射器及針頭，以避免觸碰到坐骨神經(jīng)的方式入針，將病毒載體注入右脛前肌；
4、將針頭緩慢抽出，輕輕施加壓力以防止回流；
5、將小鼠放在加熱墊上直至恢復(fù)，然后放回籠中飼養(yǎng)觀察，注射病毒4周后可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
小鼠肌肉注射示意圖
（https://www.theodora.com/rodent_laboratory/injections.html）
四、不同注射方式的AAV給藥劑量
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脛前肌/腓腸?。?/span>
20~25μL
股四頭?。?/span>
50~100μL
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心包內(nèi)注射（針對(duì)心?。?/span>
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不超過250μL，
50μL/次
（總量超過250μL可能會(huì)導(dǎo)致心臟損傷或者死亡）
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注：選擇的血清型和載體的濃度決定了每種注射方式的給藥劑量，具體實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)綜合考慮各種因素。
五、參考文獻(xiàn)
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4、Arnett AL, et al.Heparin-binding correlates with increased efficiency of AAV1- and AAV6-mediated transduction of striated muscle, but negatively impacts CNS transduction. Gene Ther. 2013 May;20(5):497-503.
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6、Kwong JQ, et al.The mitochondrial calcium uniporter underlies metabolic fuel preference in skeletal muscle. JCI Insight. 2018 Nov 15;3(22):e121689.
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8、Witcher PC, et al.Expression of Myomaker and Myomerger in myofibers causes muscle pathology. Skelet Muscle. 2023 May 1;13(1):8.
9、Mohammadsharif Tabebordbar，et al.Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species .Cell.2021
