AAV在內(nèi)耳的靶向應(yīng)用策略（下）
AAV載體憑借其高安全性，低免疫原性等優(yōu)勢，可以安全地轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和感官系統(tǒng)，并在多種疾病的基因治療中顯示出巨大潛力，這為遺傳性耳聾的治愈帶來了新的希望。目前，已有多項(xiàng)研究表明，使用AAV作為基因治療載體可以部分或完全恢復(fù)遺傳性耳聾小鼠模型的聽力。上期內(nèi)容，我們分享了關(guān)于AAV在內(nèi)耳應(yīng)用中的啟動(dòng)子和注射方式的選擇策略：AAV在內(nèi)耳的靶向應(yīng)用策略（上），本期我們將繼續(xù)分享內(nèi)耳應(yīng)用中AAV血清型、載體的選擇和優(yōu)秀案例。
一、AAV血清型選擇
1、新生小鼠
①傳統(tǒng)AAV血清型中，AAV1是新生小鼠內(nèi)耳基因傳遞使用最廣泛的血清型之一，可轉(zhuǎn)導(dǎo)毛細(xì)胞、支持細(xì)胞、血管紋、前庭神經(jīng)上皮多種細(xì)胞類型，并且通過圓窗膜注射方式可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)毛細(xì)胞。其它血清型AAV2、AAV6、AAV8、AAV9以不同的效率感染新生小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞（圖1）。
圖1. 相比其它天然AAV，AAV1在體外可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)離體培養(yǎng)的小鼠耳蝸毛細(xì)胞
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
②與傳統(tǒng)的AAV血清型相比，變體Anc80L65可介導(dǎo)靶基因在新生小鼠外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞中的高效穩(wěn)定傳遞（圖2）。
圖2. 相比傳統(tǒng)AAV血清型，Anc80L65在體外可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠耳蝸外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
圖3. 相比傳統(tǒng)AAV血清型，Anc80L65在體內(nèi)可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)新生小鼠耳蝸內(nèi)毛和外毛細(xì)胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
③經(jīng)后半規(guī)管注射后，變體AAV2.7m8可在體內(nèi)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)新生小鼠外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞，并且在外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)方面明顯優(yōu)于Anc80L65（圖4）。此外，AAV2.7m8還能夠感染支持細(xì)胞亞群(內(nèi)柱細(xì)胞和內(nèi)指細(xì)胞)(圖5），這些支持細(xì)胞亞群被認(rèn)為能夠高效促進(jìn)毛細(xì)胞再生。
圖4. AAV2.7m8在體內(nèi)高效感染新生小鼠耳蝸外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
圖5. AAV2.7m8在體內(nèi)高效感染新生小鼠內(nèi)耳支持細(xì)胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
④經(jīng)胞囊注射后，相比Anc80L65和AAV2.7m8，AAV9-PHP.B在內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞中均具有強(qiáng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并在螺旋和前庭神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中顯著轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖6. AAV9-PHP.B在體內(nèi)高效感染新生小鼠耳蝸外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞
（Lee J, et al. Hear Res. 2020）
⑤通過RWM注射，新型突變體AAV-ie-K558R可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)新生小鼠耳蝸中HC樣細(xì)胞的再生
圖7. AAV-ie-K558R-Atoh1可在新生小鼠體內(nèi)再生HC樣細(xì)胞
（Tao Y, et al.Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022）
2、成年小鼠
在成年小鼠中，相比于AAV1、AAV8、AAV9和Anc80L65血清型，AAV2可同時(shí)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞，其次是Anc80L65血清型（圖8）。
圖8. AAV2高效轉(zhuǎn)導(dǎo)成年小鼠耳蝸毛細(xì)胞
（Omichi R, et al.Mol Ther Methods Clin Dev. 2020）
二、雙AAV載體選擇
AAV有限的包裝容量（約4.7kb）使其無法遞送一些較大的基因，這在一定程度上限制了其疾病治療范圍，雙AAV（或三AAV）載體技術(shù)的發(fā)展解決了這一難題。雙AAV載體遞送策略即將要遞送的大片段基因拆分并包裝到兩個(gè)AAV載體上，其中一個(gè)AAV載體攜帶啟動(dòng)子元件和5’端外源基因CDS，另外一個(gè)AAV載體攜帶3’端外源基因CDS和polyA尾巴，載體兩端為ITR序列。將這兩個(gè)AAV載體共感染目的細(xì)胞后，外源基因的上下游部分根據(jù)AAV基因組的聚合能力進(jìn)行重組，最終產(chǎn)生一個(gè)包含完整外源基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本。目前常用的雙AAV載體策略有三種：overlapping、trans-splicing和hybrid。
圖9. 雙AAV載體策略示意圖
（Omar Akil. Hearing Research. 2020）
使用雙AAV載體遞送技術(shù)，可以將超過4 kb的編碼序列轉(zhuǎn)導(dǎo)到內(nèi)耳，這為一系列由較大基因引起的遺傳性耳聾的基因治療開辟了可能性。例如，研究人員利用雙AAV載體方法在DFNB9耳聾小鼠模型中成功實(shí)現(xiàn)了Otof基因cDNA編碼序列（～6 kb）的完整表達(dá)，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中Otof基因表達(dá)的持久恢復(fù)和耳聾表型的逆轉(zhuǎn)，而且該治療方法不僅可以在聽力發(fā)作前預(yù)防Otof-/-小鼠的耳聾，而且在聽力發(fā)作后給藥還可以持續(xù)逆轉(zhuǎn)耳聾表型，這為未來在DFNB9患者中進(jìn)行基因治療試驗(yàn)帶來了希望。
圖10. 雙AAV載體恢復(fù)P10 Otof - /- 小鼠otoferlin表達(dá)并預(yù)防耳聾
（Akil O, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019）
· 小結(jié) ·
不同的啟動(dòng)子、注射方式、血清型、病毒用量及載體遞送形式等因素均會影響AAV在內(nèi)耳的基因遞送效率，因此以上數(shù)據(jù)僅供參考，建議您在具體實(shí)驗(yàn)之前查閱相關(guān)文獻(xiàn)或技術(shù)資料，選擇合適的策略開展實(shí)驗(yàn)。
三、優(yōu)秀案例分享
文章題目：Template-independent genome editing in the Pcdh15av-3j mouse, a model of human DFNB23 nonsyndromic deafness
合作客戶：北京腦科學(xué)與類腦研究中心熊巍教授課題組
發(fā)表期刊：Cell Reports（IF9.995）
維真生物AAV2/9病毒感染耳蝸毛細(xì)胞效果圖
參考來源
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