神經(jīng)遞質(zhì)探針
1.研究背景
人類(lèi)大腦約有860億個(gè)神經(jīng)元，這些神經(jīng)元由數(shù)萬(wàn)億個(gè)突觸連接在一起。神經(jīng)元的主要功能是接收、整合和傳遞信息。它們通過(guò)電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行交流，并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，從而控制動(dòng)物的認(rèn)知和行為。
神經(jīng)科學(xué)研究的重點(diǎn)，就是從細(xì)胞和分子水平了解神經(jīng)元如何相互連接和交流，這對(duì)于解析動(dòng)物認(rèn)知和行為背后的神經(jīng)環(huán)路具有重大意義。興奮是神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞的方式，神經(jīng)纖維受到刺激后，膜內(nèi)外電位會(huì)產(chǎn)生一系列變化而產(chǎn)生興奮，興奮產(chǎn)生后先在同一個(gè)神經(jīng)元上以動(dòng)作電位的形式傳導(dǎo)，興奮跨過(guò)突觸間隙時(shí)通過(guò)電化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)變，再傳遞到下一個(gè)神經(jīng)元。
突觸處有兩種類(lèi)型的化學(xué)信使，神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)。神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)突觸間隙擴(kuò)散，特異地作用于突觸后細(xì)胞上的受體，從而完成信息傳遞功能。而神經(jīng)調(diào)質(zhì)則與突觸后細(xì)胞上的受體結(jié)合后，增強(qiáng)或削弱遞質(zhì)的效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)突觸信息傳遞。例如，谷氨酸和γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合突觸后細(xì)胞上的受體后，可以迅速地使突觸后神經(jīng)元去極化或超極化，進(jìn)而直接調(diào)控這些神經(jīng)元的活動(dòng)。對(duì)于神經(jīng)調(diào)質(zhì)，它們大多與GPCRs結(jié)合后誘發(fā)突觸前或突觸后電位，不直接引起突觸后生物學(xué)效應(yīng)，但能調(diào)節(jié)遞質(zhì)在突觸前的釋放及突觸后細(xì)胞的興奮性，調(diào)節(jié)突觸后細(xì)胞對(duì)遞質(zhì)的反應(yīng)。
操控和檢測(cè)神經(jīng)元之間的交流是神經(jīng)科學(xué)研究的主要手段，許多遺傳工具已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，這些遺傳工具通過(guò)腺相關(guān)病毒(AAV)等病毒載體用于神經(jīng)環(huán)路的操控和成像。目前，光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)工具被用來(lái)直接操控突觸前神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏漠a(chǎn)生，鈣成像用于檢測(cè)突觸后神經(jīng)元內(nèi)的信號(hào)傳遞。然而，高靈敏度、高特異性和高時(shí)空分辨率的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)檢測(cè)技術(shù)還不成熟。
傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，主要是通過(guò)微透析對(duì)腦脊液進(jìn)行采樣并生化監(jiān)測(cè)、通過(guò)碳纖電極進(jìn)行記錄，這些檢測(cè)手段各自存在諸多弊端，例如特異性差、靈敏度低和時(shí)空分辨率差，難以精確反映神經(jīng)遞質(zhì)的真實(shí)動(dòng)態(tài)信息等。為了解決這一系列的問(wèn)題，眾多神經(jīng)科學(xué)家一直在致力于優(yōu)化已有的方法或者開(kāi)發(fā)新的技術(shù)，以求彌補(bǔ)短板，取得突破。
2.開(kāi)發(fā)&原理
自2018年起，北京大學(xué)李毓龍教授課題組通過(guò)偶聯(lián)GPCR和循環(huán)重排熒光蛋白cpFP開(kāi)發(fā)出了很多檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的可遺傳編碼的熒光探針。神經(jīng)遞質(zhì)與GPCR的結(jié)合會(huì)引起后者構(gòu)象的改變，而這種變化又會(huì)引起cpFP發(fā)生構(gòu)象改變，進(jìn)而影響其發(fā)色團(tuán)周?chē)奈h(huán)境，最終導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度的改變，這種熒光變化可以通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)到(Fig 1a和1b)。這些可遺傳編碼的熒光探針被命名為GRAB(GPCR Activation-Based)探針，用于以較高的時(shí)空分辨率在體檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。
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Fig1a：綠色神經(jīng)遞質(zhì)探針（cpEGFP-based）的工作原理
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Fig1b：紅色神經(jīng)遞質(zhì)探針（cpmApple-based）的工作原理
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3.探針特征（已發(fā)表）
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探針名稱(chēng)
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所檢測(cè)神經(jīng)
化學(xué)物質(zhì)
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版本
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顏色
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骨架
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親和力
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信號(hào)響應(yīng)幅度
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動(dòng)力學(xué)
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下游
信號(hào)偶聯(lián)
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參考
文獻(xiàn)
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Ach2.0
|
乙酰膽堿
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第一代
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綠色
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人M3受體
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EC50~1uM
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ΔF/F0~90%
|
τon~200ms,
τoff~800ms
|
弱偶聯(lián)
|
[8]
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|
Ach3.0
|
乙酰膽堿
|
第二代
|
綠色
|
人M3受體
|
EC50~2uM
|
ΔF/F0~280%
|
τon~112ms,
τoff~580ms
|
幾乎不偶聯(lián)
|
[3]
|
|
Ach3.0-mut
|
乙酰膽堿
|
第二代對(duì)照
|
綠色
|
人M3受體
|
EC50~0uM
（W200A突變）
|
ΔF/F0~1.8%
|
-
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-
|
[3]
|
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DA1m
|
多巴胺
|
第一代
|
綠色
|
人D2受體
|
EC50~130nM
中等親和力
|
ΔF/F0~90%
|
τon~60ms,
τoff~700ms
|
幾乎不偶聯(lián)
|
[7]
|
|
|
DA1h
|
多巴胺
|
第一代
|
綠色
|
人D2受體
|
EC50~10nM
高親和力
|
ΔF/F0~90%
|
τon~140ms,
τoff~2500ms
|
幾乎不偶聯(lián)
|
[7]
|
|
|
DAmut(1st)
|
多巴胺
|
第一代對(duì)照
|
綠色
|
人D2受體
|
EC50~0uM
C118A和S193N突變
|
無(wú)效應(yīng)
|
-
|
-
|
[7]
|
|
|
DA2m(DA4.4)
|
多巴胺
|
第二代
|
綠色
|
人D2受體
|
EC50~90nM
中等親和力
|
ΔF/F0~340%
|
τon~40ms,
τoff~1300ms
|
非常小的偶聯(lián)
|
[2]
|
|
|
DA2h(DA4.3)
|
多巴胺
|
第二代
|
綠色
|
人D2受體
|
EC50~7nM
高親和力
|
ΔF/F0~280%
|
τon~50ms,
τoff~7300ms
|
非常小的偶聯(lián)
|
[2]
|
|
|
DAmut(2nd)
|
多巴胺
|
第二代對(duì)照
|
綠色
|
人D2受體
|
EC50~0uM
C1183.36A和S1935.42N突變
|
無(wú)效應(yīng)
|
-
|
-
|
[2]
|
|
|
rDA1m (rDA2.5m)
|
多巴胺
|
-
|
紅色
|
人D2受體
|
EC50~95nM
中等親和力
|
ΔF/F0~150%
|
τon~80ms,
τoff~770ms
|
非常小的偶聯(lián)
|
[2]
|
|
|
rDA1h (rDA2.5h)
|
多巴胺
|
-
|
紅色
|
人D2受體
|
EC50~4nM
中等親和力
|
ΔF/F0~100%
|
τon~60ms,
τoff~2150ms
|
非常小的偶聯(lián)
|
[2]
|
|
|
rDAmut (rDA2.5mut)
|
多巴胺
|
對(duì)照
|
紅色
|
人D2受體
|
EC50~0uM
C1183.36A和S1935.42N突變
|
無(wú)效應(yīng)
|
-
|
-
|
[2]
|
|
|
NE1m(NE2.1)
|
去甲腎上腺素
|
-
|
綠色
|
人a2A受體
|
EC50~930nM
中等親和力
|
ΔF/F0~230%
|
τon ~70ms,
τoff~ 750ms
|
不偶聯(lián)
|
[6]
|
|
|
NE1h(NE2.2)
|
去甲腎上腺素
|
-
|
綠色
|
人a2A受體
|
EC50~83nM
高親和力
|
ΔF/F0~130%
|
τon ~30ms,
τoff~ 2000ms
|
不偶聯(lián)
|
[6]
|
|
|
NEmut
|
去甲腎上腺素
|
對(duì)照
|
綠色
|
人a2A受體
|
EC50~0uM
S5.46A突變
|
無(wú)效應(yīng)
|
-
|
-
|
[6]
|
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Ado1.0
|
腺苷
|
-
|
綠色
|
人A2A受體
|
EC50~60nM
|
ΔF/F0~130%
|
τon~36ms,
τoff~1890ms
|
幾乎不偶聯(lián)
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[4]
|
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|
Ado1.0mut
|
腺苷
|
對(duì)照
|
綠色
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人A2A受體
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EC50~0uM
F168A突變
|
無(wú)效應(yīng)
|
-
|
-
|
[4]
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|
5-HT1.0
|
五羥色胺
|
-
|
綠色
|
人5-HT2C
受體
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EC50~22nM
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ΔF/F0~250%
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τon~0.2s,
τoff~3.1s
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不偶聯(lián)
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[1]
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5-HTmut
|
五羥色胺
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對(duì)照
|
綠色
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人5-HT2C
受體
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EC50~0uM
D1343.32Q突變
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無(wú)效應(yīng)
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-
|
-
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[1]
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4.探針資源
在李教授組的授權(quán)下，山東維真生物可以出售這些探針的病毒產(chǎn)品（AAV產(chǎn)品為主），以幫助神經(jīng)科學(xué)工作者在體內(nèi)檢測(cè)乙酰膽堿(ACh)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、腺苷(Ado)、腺苷三磷酸(ATP)、血管活性腸肽(VIP)、膽囊收縮素(CCK)、神經(jīng)肽Y(NPY)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、精氨酸血管加壓素(AVP)、催產(chǎn)素(OXT)、生長(zhǎng)激素抑制素(SST)、神經(jīng)降壓肽(NTS)、內(nèi)源性大麻素(eCB)、大麻素(AEA)和褪黑素(MT)等各種遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，歡迎大家點(diǎn)擊“AAV工具” 中的“神經(jīng)遞質(zhì)探針”進(jìn)行選購(gòu)?。?！
5.探針載體獲取
以上所述所有GRAB探針均由北京大學(xué)李毓龍組研發(fā)或聯(lián)合開(kāi)發(fā)。部分探針已經(jīng)發(fā)表，部分探針尚未發(fā)表。李毓龍組不僅開(kāi)發(fā)了這些探針，還開(kāi)發(fā)了這些探針的Cre依賴(lài)和突變版本，包括紅色和綠色的熒光信號(hào)，以滿足神經(jīng)科學(xué)工作者多樣化的實(shí)驗(yàn)需求。此外，為了提升探針的性能，這些探針還在持續(xù)優(yōu)化中，不斷更新迭代。
以上探針均由維真生物協(xié)助提供。其中已發(fā)表的探針（產(chǎn)品編號(hào)中含PUB的病毒為文章中所用病毒），維真生物均有現(xiàn)貨，當(dāng)天上午下單，下午/次日即可發(fā)貨；若由于產(chǎn)品脫銷(xiāo)無(wú)庫(kù)存，1-2周即可完成入庫(kù)并發(fā)貨；您可以通過(guò)公司技術(shù)熱線400-077-2566訂購(gòu)。
如若您對(duì)未發(fā)表的探針或者探針序列感興趣，您也可通過(guò)上述方式與我們聯(lián)系，,我們將在第一時(shí)間幫您與李教授組溝通，征得李教授組的同意之后，我們也可以出售給您。
6.探針病毒使用
由于血腦屏障的存在，普通的注射方式很難實(shí)現(xiàn)病毒在腦區(qū)較高且特異性的表達(dá)，因此研究者通常需要借助腦立體定位儀將探針病毒注射至特定腦區(qū)（詳見(jiàn)Fig 2），以感染全腦和局部腦區(qū)。
Fig2：腦立體定位注射的示意圖
(Van der Perren, A., et al, V. J. Vis. Exp. (108), e53670, doi:10.3791/53670 (2016)
腦立體定位注射的詳細(xì)步驟如下：
1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱(chēng)重，進(jìn)行麻醉；
2. 待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全麻醉后，用剃毛器將動(dòng)物頭頂眼睛至耳朵之間的毛發(fā)剃除干凈；
3. 將麻醉后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定于腦立體定位儀上，具體操作為：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼部涂抹青霉素眼藥膏以保護(hù)其雙眼；將門(mén)齒掛在門(mén)齒掛鉤上，確保頭部保持固定；檢查左右耳桿是否在同一水平上，將左右耳桿通過(guò)外耳道插入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳內(nèi)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物固定好的標(biāo)準(zhǔn)為：鼻對(duì)正中，頭部不動(dòng)，提尾不掉，目測(cè)大腦放置水平；
4. 手術(shù)：用碘伏對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物頭皮進(jìn)行消毒清理，用手術(shù)刀沿中間位置剪開(kāi)頭皮，用鑷子對(duì)表面的結(jié)締組織進(jìn)行清理，暴露實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的顱骨表面；然后進(jìn)行調(diào)平，首先找到前囟這個(gè)坐標(biāo)，并將其歸零，然后向左右調(diào)平，使左右兩側(cè)處于同一水平，調(diào)整前后囟，使前后囟也在同一水平。
5.病毒注射：通過(guò)查詢(xún)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腦立體定位圖譜確定待注射腦區(qū)的位置（Fig 3a和3b是大鼠和小鼠的腦譜），并確定其坐標(biāo)值，即ML值（X軸）、AP值（Y軸）、DV值（Z軸）；根據(jù)目標(biāo)腦區(qū)設(shè)定好坐標(biāo)，移開(kāi)注射針，用顱骨鉆開(kāi)窗（由于顱骨薄，故務(wù)必注意顱骨鉆的力度?。。?，操作時(shí)避免傷及腦組織；微量注射器吸取病毒液，隨后固定在定位儀上，根據(jù)設(shè)好的坐標(biāo)進(jìn)行病毒注射，注射速度控制在0.1-0.15μl/min，注射劑量視具體實(shí)驗(yàn)而定。注射完畢，留針10min，以便病毒液充分吸收，然后慢慢回針。
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Fig3a：The Rat Brain
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Fig3b：The Mice Brain
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6. 縫合頭皮并消毒, 完成腦定位注射; 將動(dòng)物從腦立體定位儀取下, 回籠待蘇醒; 動(dòng)物蘇醒后, 正常喂養(yǎng), 病毒注射后2-4周可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
7.常見(jiàn)問(wèn)題解答
7.1 使用探針AAV病毒注射時(shí)，我該使用多大的病毒量？
考慮到病毒批次間的差異，我們建議您直接注射未稀釋的病毒原液200-400nl/site。
7.2 神經(jīng)遞質(zhì)探針在大鼠中是否能像在小鼠中一樣表達(dá)得很好？
神經(jīng)遞質(zhì)探針在大鼠中也可以很好地工作。根據(jù)李教授組已發(fā)表的論文，這些探針可以用在多種有機(jī)體中，包括果蠅、斑馬魚(yú)、老鼠和斑馬雀等。
7.3 你們是否也有廣譜啟動(dòng)子或其他組織特異性啟動(dòng)子的探針AAV病毒？
有些探針在開(kāi)發(fā)時(shí)已構(gòu)建了廣譜啟動(dòng)子或其他組織特異性啟動(dòng)子的載體，如CAG，EFs，EF1α，CamKIIα，GfaABC1D和TRE等，具體可以參考探針資源部分的表2。當(dāng)然，如果您對(duì)其他組織特異性啟動(dòng)子感興趣，請(qǐng)參考我們的組織特異性啟動(dòng)子列表（見(jiàn)下表）來(lái)選擇您感興趣的啟動(dòng)子。如果您找不到想用的啟動(dòng)子，可以聯(lián)系我們。
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組織
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啟動(dòng)子名稱(chēng)
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啟動(dòng)子
大小
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啟動(dòng)子
來(lái)源
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啟動(dòng)子描述
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啟動(dòng)子應(yīng)用
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神經(jīng)
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hSyn
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471bp
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人源
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突觸蛋白1啟動(dòng)子
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神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子
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CamKIIa
|
1.2kb
|
小鼠
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鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶II α啟動(dòng)子
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大腦新皮質(zhì)和海馬興奮性神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子
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|
c-fos
|
1.7kb
|
小鼠
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c-fos基因啟動(dòng)子
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興奮性神經(jīng)元啟動(dòng)子
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Mecp2
|
230bp
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小鼠
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甲基 CpG 結(jié)合蛋白 2啟動(dòng)子
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短的神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子
|
|
NSE
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1.3kb
|
小鼠
|
烯醇化酶啟動(dòng)子
|
神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子
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Somatostat(SST)
|
1.2kb
|
人源
|
生長(zhǎng)抑制素I基因的啟動(dòng)子
|
gamma氨基丁酸能抑制性神經(jīng)元SST亞型特異性啟動(dòng)子
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|
TH
|
2.5kb
|
大鼠
|
酪氨酸羥化酶基因啟動(dòng)子
|
多巴胺能神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子
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GFAP
|
2.0kb
|
人源
|
膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動(dòng)子
|
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
|
|
GFAP104
|
845bp
|
人源
|
EF1a和GFAP的嵌合型啟動(dòng)子
|
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
|
|
GfaABC1D(truncated GFAP)
|
681bp
|
人源
|
膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動(dòng)子
|
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
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|
ALDH1L1
|
1.3kb
|
人源
|
醛脫氫酶1家族成員L1啟動(dòng)子
|
丘腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
|
|
MBP
|
1.3kb
|
人源
|
髓磷脂堿性蛋白啟動(dòng)子
|
少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
|
|
肝臟
|
ALB
|
2.4kb
|
小鼠
|
白蛋白啟動(dòng)子
|
肝臟特異性啟動(dòng)子
|
|
TBG
|
460bp
|
人源
|
甲狀腺素結(jié)合球蛋白啟動(dòng)子
|
肝臟特異性啟動(dòng)子
|
|
ApoEHCR-hAAT
|
1.3kb
|
人源
|
載脂蛋白E的肝細(xì)胞控制區(qū)和人α1抗胰蛋白酶啟動(dòng)子的嵌合啟動(dòng)子
|
肝臟特異性啟動(dòng)子
|
|
心臟
|
aMHC
|
0.4kb
|
小鼠
|
肌球蛋白重鏈α啟動(dòng)子
|
心臟特異性啟動(dòng)子
|
|
cTNT+intron
|
0.7kb
|
雞
|
心肌肌鈣蛋白T啟動(dòng)子
|
心肌特異性啟動(dòng)子
|
|
眼睛
|
Rep65
|
0.7kb
|
小鼠
|
視網(wǎng)膜色素上皮65啟動(dòng)子
|
視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
|
|
VMD2 promoter
|
0.65bp
|
人源
|
卵黃形成黃斑性營(yíng)養(yǎng)不良2基因啟動(dòng)子
|
視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
|
|
胰腺
|
Insulin
|
0.85kb
|
小鼠
|
胰島素基因啟動(dòng)子
|
胰腺β細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
|
|
PDX1
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2.7kb
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小鼠
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胰十二指腸同源盒1啟動(dòng)子
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胰腺β細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
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血管
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SM22a
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0.45kb
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小鼠
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SM22α啟動(dòng)子
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血管平滑肌特異性啟動(dòng)子
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ICAM2
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0.15kb
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人源
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細(xì)胞間粘附分子2啟動(dòng)子
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血管內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子
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CD68
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0.7kb
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人源
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CD68分子啟動(dòng)子
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單核巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
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F4/80
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1.2kb
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小鼠
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F4/80基因promoter
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巨噬細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
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肌肉
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MCK
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1.3kb
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小鼠
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肌酸激酶基因啟動(dòng)子
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肌肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
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3×enhancer McK
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728bp
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小鼠
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修改的肌酸激酶基因啟動(dòng)子
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肌肉細(xì)胞特異性啟動(dòng)子
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腎臟
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NPHS1
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1.2kb
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小鼠
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Nephrin 1基因啟動(dòng)子
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腎臟特異性啟動(dòng)子
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7.4 你們探針AAV病毒的最小規(guī)格是多少？
我們的探針AAV病毒是按照50μl/支的規(guī)格進(jìn)行分裝的，因此出售的最小規(guī)格是50μl。
7.5 AAV血清型很多，你們有其他血清型的探針AAV病毒嗎，比如逆行AAV血清型？
對(duì)于大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)探針，我們通常將其包裝成AAV9血清型，目前還沒(méi)有嘗試逆行AAV血清型。如果您需要逆行血清型，我們也可以幫您包裝。目前我們可以為您包裝AAV1，AAV2， AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAVrh10，AAV retro，AAV ANC80，AAV DJ & AAV DJ-8，AAV PhpB & AAV PhpeB，AAV 7m8和AAV shh10等血清型。
8.參考文獻(xiàn)
8.1 Wan, J., et al. (2021). "A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics." Nat Neurosci.
8.2 Sun, F., et al. (2020). "Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo." Nat Methods 17(11): 1156-1166.
8.3 Jing, M., et al. (2020). "An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity." Nat Methods 17(11): 1139-1146.
8.4 Peng, W., et al. (2020). "Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons." Science 369(6508).
8.5 Jing, M., et al. (2019). "G-protein-coupled receptor-based sensors for imaging neurochemicals with high sensitivity and specificity." J Neurochem 151(3): 279-288.
8.6 Feng, J., et al. (2019). "A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Vivo Detection of Norepinephrine." Neuron 102(4): 745-761 e748.
8.7 Sun, F., et al. (2018). "A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice." Cell 174(2): 481-496 e419.
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