分子克隆
【分子克隆】第一期：認識分子克隆
概念原理：
分子克隆技術(shù)又稱基因克隆或DNA重組技術(shù) ，是在體外對DNA分子按照既定的目的和方案進行人工重組，然后將重組分子（目的基因或DNA片段與合適的載體連接）導入到合適的受體細胞中，使其在細胞中復制與擴增，以獲得多拷貝的DNA分子，并使受體細胞獲得新的遺傳特征的過程。
技術(shù)流程：
1. 目的基因克隆
從特定的生物基因組或cDNA中分離和擴大繁殖獲得足夠量的目的基因或 cDNA序列。
2. 載體的準備
選擇合適的載體，并對載體DNA進行克隆，制備足夠量的達到一定純度的載體。
3. 目的基因與載體的酶切、連接
選擇適當?shù)目寺〔呗?，將目的基因連接于載體的多克隆位點或啟動子和終止子之間，實現(xiàn) DNA 重組。
4. 重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導
將重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導進入大腸桿菌細胞、酵母菌細胞、植物外植體或動物細胞。
5. 重組體的篩選與鑒定
利用載體上提供的選擇標記基因進行篩選，獲得具有重組DNA分子的陽性克隆，或通過植株再生、胚移植等手段獲得轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因動物。還需對所獲得的轉(zhuǎn)化細胞、轉(zhuǎn)基因植株或轉(zhuǎn)基因動物進行分子鑒定。
6. 重組體的大量培養(yǎng)，外源基因表達效應分析與開發(fā)應用
將經(jīng)篩選和鑒定出來的大腸桿菌、酵母轉(zhuǎn)化細胞進行大量擴大繁殖，對外源基因的表達蛋白進行分離與純化并進行后續(xù)結(jié)構(gòu)與功能的研究。
【分子克隆】第二期：分子克隆，從認識質(zhì)粒開始
載體：
載體是用于攜帶重組DNA，并且能夠使外源DNA一起復制與表達的運載工具。
質(zhì)粒：
質(zhì)粒是一種獨立于宿主細胞染色體以外，能獨立自主復制的遺傳單位。它們常見的形式是細菌中環(huán)狀的雙鏈DNA分子，有的也存在于古細菌和真核生物中，其大小在1～200kb不等。質(zhì)粒是“裸”DNA，不編碼必要的基因，在自然界中，質(zhì)粒通常攜帶有利于有機體生存的基因，并賦予諸如抗生素耐藥性等選擇優(yōu)勢。
質(zhì)粒在遺傳工程中占有重要的位置，它被認為是復制子，能夠在合適的宿主內(nèi)自主復制的DNA單位，被廣泛用作分子克隆的載體，驅(qū)動宿主體內(nèi)重組DNA序列的復制，在實驗室中，質(zhì)?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)化進入細胞。
細菌的DNA與質(zhì)粒（來源：維基百科）
質(zhì)粒的分類：
質(zhì)?？梢园凑斩喾N方式進行分類。
1、按照質(zhì)粒能否通過細菌的接合作用，可分為接合性質(zhì)粒和非接合性質(zhì)粒。 接合質(zhì)粒含有促進不同細胞間性結(jié)合的轉(zhuǎn)移基因，在復雜的接合過程中，質(zhì)?？赏ㄟ^某些轉(zhuǎn)移基因編碼的性菌毛從一個細菌轉(zhuǎn)移到另一個細菌，非接合質(zhì)粒不能起始接合，因此只能借助接合質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)移。
2、根據(jù)質(zhì)粒的不相容性，可分為不相容性和相容性。 一個微生物可以容納不同類型的質(zhì)粒，但不同的質(zhì)粒只有在相容的情況下才能存在于一個細菌細胞中。如果兩個質(zhì)粒不相容，其中一個或另一個會迅速從細胞中消失。
3、根據(jù)復制性質(zhì)，可分為嚴緊控制型和松弛控制型。 嚴緊控制復制型質(zhì)粒的復制酶系與染色體DNA復制共用，只能在細胞周期的一定階段進行復制，當細胞染色體停止復制時，質(zhì)粒也就不再復制。松弛控制復制型的質(zhì)粒的復制酶系不受染色體DNA復制酶系的影響，在整個細胞生長周期中隨時都可以復制，在染色體復制已經(jīng)停止時質(zhì)粒仍能繼續(xù)復制。
4、此外，根據(jù)質(zhì)粒的功能不同， 質(zhì)粒還有如下的分類，如致育質(zhì)粒、抗性質(zhì)粒、Col質(zhì)粒、降解質(zhì)粒、侵入性質(zhì)粒。
【分子克隆】第三期：質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建的先決條件
用于攜帶DNA片段進入宿主細胞進行復制或保存的載體必須滿足以下基本條件：①具有對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性，能攜帶外源其因進入宿主細胞；②能在宿主細胞中自主復制，并實現(xiàn)外源基因的增殖；③具有由單一限制性內(nèi)切核酸酶識別位點組成的多克隆位點（mulfiple cloning site，MCS），可供外源基因的插入；④具有合適的選擇性標記，用于含有重組質(zhì)粒的宿主細胞篩選。
天然質(zhì)粒往往存在這樣或那樣的缺陷，不適宜直接用作克隆載體，常需要進行人工改造。結(jié)合上述條件，這些改造也就主要集中在以下幾個方面∶
（1）選擇合適的復制起始位點。 為了使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體能在受體細胞中進行有效復制，且獲得足夠數(shù)量的拷貝數(shù)，需要改變復制起始位點，一般選擇組裝松散型質(zhì)粒復制起始位點。
（2）加入合適的選擇標記基因。 為便于重組子篩選，需要在質(zhì)?？寺≥d體上加入合適的標記基因，主要有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）和抗生素抗性基因。前者用于克隆子藍、白斑篩選；常用的抗生素抗性基因主要有氨芐青霉素抗性其因（ampicillin resistance gene，ampr)、四環(huán)素抗性基因（tetracycline resistance gene，tetr）、氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene，cmr）、卡那霉素抗性其因（kanamycin resistance gene，kanr）和新霉素抗性基因（neomycin resistance gene，neor）等。
（3）增加或減少酶切位點。 質(zhì)粒載體利用限制性內(nèi)切核酸酶識別位點來作為外源DNA片段插入的克隆位點，這種位點必須是單一酶切位點，而且數(shù)量越多越便于多種類型末端的DNA插入。可通過刪除天然質(zhì)粒中的部分重復的限制性內(nèi)切核酸酶識別位點使之成為單一酶切位點，也可通過增加新的單一限制性內(nèi)切核酸酶位點，在特定的部位（如在篩選標記基因上）組裝一個含有多種單一限制性內(nèi)切核酸酶識別序列的多克隆位點（MCS）。
（4）縮短長度。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細胞的效率同質(zhì)粒DNA分子大小相關(guān)，小分子質(zhì)量質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率較高?？赏ㄟ^切去質(zhì)粒上不必要的片段，提高轉(zhuǎn)化宿主細胞的效率，提高其外源 DNA 片段的裝載量。
經(jīng)過改進和創(chuàng)新的克隆載體越來越小、容量越來越大、工作效率越來越高、使用也越來越方便。
【分子克隆】第四期：載體的分類
1、按屬性分類：可分為病毒載體和非病毒載體
病毒載體 是指以病毒為基礎(chǔ)的基因載體，具體方法是對病毒基因組進行操作和改造，使它攜帶外源基因和相關(guān)基因元件，并被包裝成病毒顆粒，病毒載體是一種常見的分子生物學工具。用于基因?qū)氩⒛茉谂R床開展研究的病毒載體一般應具備以下基本條件：
①攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒；
②介導外源基因的轉(zhuǎn)移和表達；
③對人體不致??；
④在環(huán)境中不會引起增殖和傳播。
非病毒載體 一般是指質(zhì)粒DNA，也可以是無載體的核酸，如反義寡核苷酸、Ribozyme、siRNA等，它是利用非病毒的載體材料的物化性質(zhì)來介導基因的轉(zhuǎn)移。
2、按進入受體細胞的類型分類：原核載體、真核載體、穿梭載體
（含原核和真核2個復制子，能夠在原核和真核兩種宿主細胞中復制，并可以在真核細胞中有效表達）。
3、按功能分類：克隆載體、表達載體
克隆載體： 具有克隆載體的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以攜帶DNA片段或外源基因進入受體細胞并克隆和大量擴增DNA片段（基因）的載體。
表達載體： 克隆載體中加入一些與表達調(diào)控（具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序）有關(guān)的元件即稱為表達載體。
【分子克隆】第五期：原核表達載體
原核表達載體 即能攜帶插入的外源基因序列進入原核細胞中進行表達的載體。
1、原核表達載體的表達元件
①啟動子
啟動子的強弱是影響表達量的決定因素之一，原核表達載體啟動子主要有l(wèi)ac、 trp、tac、T7噬菌體啟動子和IPL啟動子。乳糖操縱子中l(wèi)ac啟動子 的轉(zhuǎn)錄可通過CAP和cAMP來激活，又被調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合所阻止。乳糖類似物 IPTG可與阻遏蛋白結(jié)合解除阻礙，因此可用IPTG來調(diào)控 lac啟動子的表達。色氨酸啟動子trp的阻遏蛋白須與色氨酸結(jié)合才有活性。tac是由lac和trp構(gòu)建的雜合啟動子 ，受IPTG的誘導，啟動能力比lac和trp強。T7噬菌體啟動子 具有高度特異性，只有T7 RNA聚合酶才能使其啟動，而且T7 RNA聚合酶比大腸桿菌聚合酶活性高得多，可用來高效表達基因。IPL是噬菌體的早期左向啟動子 ，活性比trp高11倍，受溫度的調(diào)控。
②轉(zhuǎn)錄終止子
在構(gòu)建表達載體時，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因表達干擾載體的穩(wěn)定性，一般在多克隆位點的下游插入一段轉(zhuǎn)錄終止子。
③核糖體結(jié)合位點
轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須借助宿主細胞的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)翻譯出目的蛋白。細胞中的核糖體必須在mRNA上找到有效核糖體結(jié)合位點以及其中的SD（Shine-Dalgarno）序列，從而啟動臨近的翻譯起始密碼子的蛋白質(zhì)翻譯。核糖體結(jié)合位點可由目的基因自己帶入，也可利用載體預先裝載（一般要與ATG相隔3～11 bp）。
2、原核表達載體的表達方式
①組成型表達 T7噬菌體啟動子等屬于組成型啟動子，在該類啟動子的驅(qū)動下，外源基因源源不斷地表選。組成型表達通常產(chǎn)量高，但不適合表達一些對宿主細胞有害的蛋白。
②誘導型表達 lac及其衍生tac啟動子都是IPTG誘導型啟動子，trp是色氨酸誘導型啟動子，IPL的表達受溫度調(diào)控。這些誘導型啟動子的可控性表達，既可避免表達產(chǎn)物對宿主前期生長的不利影響，又可減少基因表達產(chǎn)物遭受蛋白酶的降解作用，特別適合有毒蛋自的表達。
③融合型表達 表達載體的多克隆位點上有一段融合表達標簽（tag），表達為融合蛋白（N端融合或C端融合），可方便后續(xù)的蛋白分離純化或檢測。常見的融合表達標簽有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因（GST）標簽或6×His標簽。對于特別小的目的蛋自，使用分子質(zhì)量較大的GST標簽為好。
④分泌型表達 在起始密碼和目的基因之間加入一個信號肽，可以引導目的蛋白穿越細胞膜?？杀苊獗磉_產(chǎn)物在細胞內(nèi)過度積累而影響細胞的生長，或者形成包含體，而且表達產(chǎn)物是可溶性的，不需要復性。
【分子克隆】第六期：真核表達載體
1. 酵母表達載體
由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等翻譯后修飾反應機制的差異，真核基因的原核表達難以獲得有活性的蛋白，酵母成為了真核表達的首選系統(tǒng)。
酵母表達載體多數(shù)從pBR322基本骨架衍生而來，含有該質(zhì)粒復制起始位點（ori），lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。啟動子有GAP，AOX1、AUG1和GAL1等.其中，GAP是組成型啟動子，AOX1，AUG1和GAL1分別受甲醇、半乳糖和維生素B1等誘導表達的誘導型啟動子。
酵母表達載體多為穿梭載體，既可以在大腸桿菌中繁殖，獲得足夠的載體DNA進行體外操作，又可以在酵母中復制、表達和選擇。
2. Ti質(zhì)粒表達載體
Ti質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）是根據(jù)農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的可引發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤的質(zhì)粒。Ti質(zhì)?？煞譃門-DNA、Vir、Con 和Ori 4個功能區(qū)。
利用T-DNA可攜帶外源DNA片段并整合到植物基因組的特性，經(jīng)對天然Ti質(zhì)粒的改造，用于構(gòu)建植物遺傳轉(zhuǎn)化的表達載體，分為一元表達載體和雙元表達載體等類型。
3. 動物表達載體
這類載體是由質(zhì)粒作為基本骨架構(gòu)建而成，帶有原核復制區(qū)、選擇性標記基因、啟動子、polyA尾信號序列、動物細胞中的選擇基因[neor、胸苷激酶基因（tk）、綠色熒光蛋白基因（gfp）和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（aprt）]等有關(guān)元件。山羊乳腺特異性表達載體（pBC1）是典型的動物質(zhì)粒表達載體。
【分子克隆】第七期：病毒表達載體
病毒表達載體是以病毒基因組序列為基礎(chǔ)，插入必要的表達載體元件所構(gòu)建成的真核基因轉(zhuǎn)移工具。這些表達載體元件有①源于病毒的啟動子和增強子；②病毒的復制子序列以及所需的反式作用因子編碼基因；③poly A加尾信號。
病毒表達載體可用于∶①外源蛋白的真核表達；②基因治療；③多價、多聯(lián)活載體疫苗的研制；④基因功能的鑒定
病毒載體大體上可分為兩種類型
重組型病毒載體
以完整的病毒基因組為改造對象，一方面選擇性地刪除病毒的某些必需基因，缺失的必需基因的功能由互補細胞反式提供；另一方面用外源基因表達單位替代病毒非必需基因區(qū)；而病毒復制和包裝所需的順式作用元件不變。這類載體一般通過同源重組方法將外源基因表達單位插入病毒基因組中。
無病毒基因的病毒載體
這類載體系統(tǒng)往往由載體質(zhì)粒和輔助系統(tǒng)組成。重組載體質(zhì)粒主要由外源基因表達盒、病毒復制和包裝所必需的順式作用元件及質(zhì)粒骨架組成。輔助系統(tǒng)包括病毒復制和包裝所必需的所有反式作用元件。在輔助系統(tǒng)的作用下，重組載體質(zhì)粒（包含或不包含質(zhì)粒骨架）以特定形式（單鏈或雙鏈，DNA或 RNA）被包裝到病毒殼粒中，其中不含有任何病毒基因。
這類載體的優(yōu)點在于載體病毒本身安全性好，容量大；缺點在于往往需要輔助病毒參與載體DNA的包裝，而輔助病毒又難以同載體病毒分離開來，造成最終產(chǎn)品中輔助病毒污染，從而影響其應用。實際上，無病毒基因的病毒載體可以看作是重組病毒載體的一種極端減毒情況。重組AAV 載體就屬于無病毒基因的病毒載體。
【分子克隆】第八期：腺病毒載體
腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，在自然界中廣泛分布。完整的病毒顆粒為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑70-100nm，衣殼含有240個六鄰體（hexon）、12個五鄰體（penton）、12根纖毛（fiber）及一些小蛋白等。哺乳動物腺病毒的基因組DNA長約36kb，基因組的兩端各有約100bp的反向末端重復序列（ITR），ITR與末端蛋白（TP）相結(jié)合，與基因組復制及早期基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，ITR的內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號Ψ，參與腺病毒基因組的衣殼化。
基于人血清5型腺病毒的基因組結(jié)構(gòu)，結(jié)合各基因的功能，科學家們開發(fā)了缺失E1和E3基因的Ad5腺病毒載體。E1基因在組裝感染性病毒顆粒時必不可少，但是可以在HEK293包裝細胞中得到補充，而E3基因不影病毒的包裝。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒載體可插入高達7.5kb的外源基因。
腺病毒感染細胞的原理
腺病毒通過其纖毛蛋白C端的球狀結(jié)構(gòu)域與細胞表面特異性受體（Ad5腺病毒特異性識別細胞表面的CAR受體；Ad5/F35腺病毒能特異性識別細胞表面的CD46受體）結(jié)合，同時病毒的五鄰體蛋白與細胞表面的整聯(lián)蛋白αvβ3和αvβ5相互作用，通過細胞內(nèi)吞完成病毒的內(nèi)化。
關(guān)于E1與E3基因
E1基因是一種早期最先啟動的基因，對于腺病毒其他早期基因的轉(zhuǎn)錄是必需的，因此缺失E1的腺病毒載體不能有效復制和產(chǎn)生各種病毒蛋白，從而不能完成病毒生活周期。腺病毒的E3區(qū)編碼5-9個蛋白，主要功能都是幫助受染細胞逃逸機體免疫系統(tǒng)的識別和清除。
Ad5與Ad5/F35對比
Ad5腺病毒的高效感染依賴于靶細胞膜上的CAR和αvβ整合素，但是一些免疫細胞的細胞膜上卻缺乏這些受體，如造血干細胞。這就使得研究人員尋找新的腺病毒血清型，最終發(fā)現(xiàn)F35血清型對造血干細胞有很強的靶向性，因此，嵌合型Ad5/F35應用而生。下面是Ad5 & Ad5/F35的結(jié)構(gòu)示意圖和區(qū)別：
腺病毒種類
載體特點
功能
感染細胞受體
包裝系統(tǒng)
AdV5
缺失E1和E3基因，允許插入長約8kb的外源基因
除免疫、血液類細胞外，
感染大部分細胞
CAR
AdMax
AdV5/F35
一個嵌合型腺病毒載體，主要結(jié)構(gòu)是在AdV5的基礎(chǔ)上，其受體結(jié)合位置的纖突(Fiber)改造成了F35型腺病毒(F35)的纖突(纖毛蛋白的Knob和shaft)。其細胞受體從AdV5的CAR變成了CD46，其他的基因仍舊保留AdV5載體的特性，能有效轉(zhuǎn)導CAR表達不足的多種重要靶細胞，尤其是對腫瘤細胞及造型干細胞、間充質(zhì)干細胞等有較高的感染效率。
理論上感染所有有細胞核的細胞
CD46
AdMax
【分子克隆】第九期：腺相關(guān)病毒載體（一）
腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一種單鏈DNA復制缺陷型細小病毒，它的生命周期依賴于復制病毒的參與。AAV基因組大小為4.7 kb，由末端反向重復序列ITR和中間的rep、cap基因組成。ITRs對于病毒的復制和包裝具有重要作用；rep基因編碼參與病毒復制、包裝和基因組整合的非結(jié)構(gòu)蛋白，cap基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，3種蛋白分別按1:1:10的比例組裝形成病毒衣殼，充當病毒基因傳遞載體。此外，cap基因內(nèi)嵌套的另一個開放閱讀框編碼裝配激活蛋白AAP，參與衣殼蛋白的靶向和裝配。
AAV轉(zhuǎn)導細胞主要經(jīng)歷了細胞表面受體介導的內(nèi)吞、逃離內(nèi)體、入核、脫衣殼和雙鏈轉(zhuǎn)化幾個過程。進入細胞后，可以在輔助病毒的存在下進入其復制周期。
AAV轉(zhuǎn)導細胞過程
重組AAV載體可以通過將內(nèi)源性的rep和cap基因替換為一個表達盒，該表達盒由一個啟動子驅(qū)動一個感興趣的轉(zhuǎn)基因和一個poly（A）尾巴組成。通過包裝質(zhì)粒反式提供rep和cap基因以及腺病毒輔助質(zhì)粒來包裝載體。病毒編碼序列的完全去除使AAV的包裝能力最大化（包裝容量為4.5Kb），并且有助于它們在體內(nèi)遞送時的低免疫原性和細胞毒性。
重組AAV載體
基因工程化的AAV能轉(zhuǎn)導外源基因，借助特定啟動子、光遺傳學/化學遺傳學元件、鈣指示劑、神經(jīng)遞質(zhì)探針或Cre/lox P，F(xiàn)lp／FRT重組酶技術(shù)，可選擇性地標記特定的神經(jīng)元。重組AAV基因傳遞效果好、缺乏致病性和安全性高、宿主細胞范圍廣、在體內(nèi)表達時間長，是目前最有前途和最成功的基因治療載體之一。
【分子克隆】第十期：腺相關(guān)病毒載體（二）
AAV血清型
現(xiàn)階段研究人員已發(fā)現(xiàn)12種人類AAV 血清型（AAV1至AAV12）和 100多種非人類靈長動物AAV血清型。不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)、序列和組織特異性，因而其識別與結(jié)合的細胞表面受體也相應有很大差別，這也導致不同血清型轉(zhuǎn)染的組織類型、細胞類型和感染效率也各不相同。
已批準用于商業(yè)用途的：AAV1和AAV2；
臨床使用頻率最高的：AAV2；AAV8，AAV9，AAVRh10；
AAV8，AAV9：靶向全身的多種肌肉類型；
幾乎所有天然AAV衣殼都可以在全身給藥后有效地轉(zhuǎn)到肝臟；
Serotype
Glycan recognitiona
Coreceptor
AAV1
Neu5Aca2-3GalNAcβ1-4GlcNAc
Unknown
AAV2
6-O-and N-sulfated heparin
Fibroblast / hepatocyte growth factor receptor;
laminin receptor;
integrin αVβ5 and α5β1
AAV3
2-O-and N-sulfated heparin
Hepatocyte growth factor receptor; Laminin receptor
AAV4
Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc
Unknown
AAV5
Neu5Acα2-3(6S)Galβ1-4GlcNAc
Platelet-derived growth factor receptor
AAV6
Neu5Acα2-3GalNAcβ1-4GlcNAc; N-sulfated heparin
Epidermal growth factor recepto
AAV7
Unknown
Unknown
AAV8
Unknown
Laminin receptor
AAV9
Galactose
Laminin receptor
人類AAV1至AAV9識別的細胞表面受體
Tissue
Optimal Serotype
CNS
AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8，AAV9
Heart
AAV1，AAV8，AAV9
Kidney
AAV2
Liver
AAV7，AAV8，AAV9
Lung
AAV4，AAV5，AAV6，AAV9
Pancreas
AAV8
Photoreceptor Cells
AAV2，AAV5，AAV8
RPE(Retinal Pigment Epithelium)
AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8
Skeletal Muscle
AAV1，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9
AAV1至AAV9的不同組織親噬性
怎樣實現(xiàn)器官/細胞特異的表達？
1. 局部注射，直接在想表達的地方注射 rAAV ，適合器官水平特異感染，容易操作。
2. 使用組織/器官特異啟動子來表達外源基因包裝 rAAV， rAAV 即使感染了其他組織也由于特異性啟動子而不會在其他組織中表達。
3.Cre-on，F(xiàn)lex，DIO，double floxed :使用 Cre-Loxp 系統(tǒng)，經(jīng)過兩次染色體重組在特定臟器中表達外源基因。
ssAAV & scAAV
目前，研究人員常用的兩類AAV分別為single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是基于2個基礎(chǔ)被開發(fā)的：一個是理論基礎(chǔ)：無論scAAV還是rAAV，病毒顆粒中均可包裹二倍體，甚至四倍體的AAV基因組DNA；一個是結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：wtAAV ITR序列的特殊性(T型結(jié)構(gòu))。ssAAV包裝基因組正義鏈和反義鏈的幾率一樣。ssAAV在入核、脫衣殼后，需要借助宿主DNA聚合酶或者分子間退火完成雙鏈轉(zhuǎn)化，才能啟動基因轉(zhuǎn)錄過程，而scAAV中已存在雙鏈，它入核后即可啟動基因轉(zhuǎn)錄，跨過了雙鏈轉(zhuǎn)化的步驟，從而實現(xiàn)外源基因的快速表達。
ssAAV和scAAV向靶細胞中遞送外源基因的過程：
【分子克隆】第十一期：慢病毒載體
慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，能夠感染分裂和非分裂的細胞，從而將它們與普通的逆轉(zhuǎn)錄病毒區(qū)別開來。慢病毒基因組由兩個拷貝的單鏈RNA組成，并被結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白包裹在衣殼中，這些結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白包括逆轉(zhuǎn)錄酶（將RNA轉(zhuǎn)化為dsDNA）和DNA整合酶（將dsDNA整合到宿主基因組中）。
慢病毒
圖1. 慢病毒的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)導
如上圖步驟｜，用包膜、轉(zhuǎn)移和包裝載體轉(zhuǎn)染慢病毒包裝細胞系。包膜、轉(zhuǎn)移和包裝載體轉(zhuǎn)錄的mRNA分別被翻譯成：通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入細胞膜的病毒包膜蛋白（2a）；單鏈RNA病毒基因組（2b）；病毒結(jié)構(gòu)蛋白和酶（2c），這三種成分組裝成病毒顆粒，從宿主細胞膜上出芽。
如上圖步驟‖，病毒顆粒通過包膜蛋白附著在宿主細胞表面受體上，病毒與宿主質(zhì)膜融合釋放結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和病毒基因組。病毒RNA被逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，并與整合酶形成預整合復合物，整合酶通過核孔復合物，催化病毒DNA整合到宿主基因組中，最后轉(zhuǎn)移載體啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達。
人類免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）作為典型的慢病毒，其基因Gag、Pol和Env分別編碼結(jié)構(gòu)核心蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶以及包膜糖蛋白；Tat和Rev參與病毒復制：Tat啟動病毒基因組轉(zhuǎn)錄，并受長末端重復序列驅(qū)動，Rev促進病毒mRNA的核輸出，并受到Rev響應元件的調(diào)控；包裝信號(Ψ)是將病毒基因組進入衣殼的關(guān)鍵。此外，HIV-1基因組中包含的毒力因子Vif、Vpr、Vpu和Nef會干擾宿主防御機制，并包含在組裝好的病毒粒子中。（圖2）
圖2. HIV基因組
慢病毒是以HIV-1為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。
第一代慢病毒載體將所有包裝元件編碼在一個載體上，生物安全風險較高；
第二代慢病毒載體去除了毒力因子并將包膜從包裝載體中分離，提高了安全性并增強了病毒復制，而不干擾有功能的病毒粒子的生產(chǎn)。此外，3’LTR包含U3缺失，可以消除病毒基因組復制的啟動子活性，并在不影響病毒粒子滴度或轉(zhuǎn)基因表達的情況下自滅活載體。
第三代慢病毒載體從包裝載體中去除Rev，并用轉(zhuǎn)移載體上游的一個組成啟動子替換Tat，是目前被廣泛應用的慢病毒包裝載體。（圖3）
圖3. 第2代和第3代慢病毒系統(tǒng)示意圖
慢病毒感染細胞的過程
【分子克隆】第十二期：PCR引物設(shè)計注意事項
引物是指在PCR反應中與待擴增的靶DNA區(qū)段兩翼互補的寡聚核苷酸，其本質(zhì)是單鏈 DNA片段。PCR擴增產(chǎn)物的大小及擴增的靶序列在基因組中的位置是由引物限定的，因此，引物的選擇對PCR 成功與否具有決定性意義。引物設(shè)計質(zhì)量是影響PCR擴增成敗的關(guān)鍵因素，一般要考慮以下幾個問題：
① 引物長度一般16~30 bp為宜、20~24 bp為佳。引物長度較短一般會降低擴增特異性，但會提高有效性，擴增的產(chǎn)物種類會增多。
② G+C含量一般為40%~60%為佳，兩條引物G+C含量應盡量相似，Tm最好接近，差異最好在1℃以內(nèi)，最多不超過5℃。
③ 兩個引物之間不應發(fā)生互補，特別應避免形成"引物二聚體"，如果無法避免，其3'端互補不應大于2個堿基，應盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶連續(xù)排列，避免同源序列（尤其 6個堿基以上相同）。
④ 引物內(nèi)部避免形成次級結(jié)構(gòu)，尤其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp，必要時應通過計算機進行結(jié)構(gòu)分析。
⑤ 引物的延伸從3'端開始，3'端不能進行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能，3'末端最后1個堿基最好是G或C。
⑥ 引物的5'端限定著PCR產(chǎn)物的長度，對擴增特異性影響不大，因此，5'端可以被修飾而不影響擴增的特異性。
⑦ 引物3'端不要終止于編碼區(qū)城密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。
引物設(shè)計可借助于一些計算機引物設(shè)計軟件方便地進行。目前用于引物設(shè)計的欽件有多種，其中Oligo6、Prmer5.0是非常方便且功能強大的引物設(shè)計分析軟件。
【分子克隆】第十三期：PCR技術(shù)（一）
聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是 Kary M u l l i s 于1985年發(fā)明的核酸體外擴增技術(shù)，是分子克隆研究中不可或缺的基本技術(shù)。隨著分子生物學的發(fā)展，人們在PCR基本技術(shù)的基礎(chǔ)上，不斷地推陳出新，發(fā)展了多種PCR延伸技術(shù)（反轉(zhuǎn)錄PCR、錨定PCR、巢式 PCR、實時定量PCR等等），以適應不同的用途。
1. PCR技術(shù)原理
在有DNA單鏈、與DNA單鏈互補的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情況下，引物與單鏈的互補區(qū)結(jié)合后，在DNA聚合酶的催化作用下即可進行DNA單鏈的5'→3'合成反應。通過特殊的儀器不斷滿足上述條件，則DNA單鏈的5'→3'合成反應可不斷進行下去，直到條件不復存在，實質(zhì)上是模擬天然DNA的復制過程。
2. PCR基本過程
PCR包括三個基本過程：變性、退火和延伸。
①變性（denaturation）：92~96℃的高溫處理可使模板DNA雙鏈間氫鍵斷裂，解離成單鏈但不改變其化學性質(zhì)，變性的時間一般為30 s，如果模板的G+C含量較高，變性時間可適當延長。
②退火（annealing）：將溫度降低到55℃左右，使引物與模板的互補區(qū)結(jié)合。退火的溫度取決于引物的Tm值，并通過預備試驗最終確定。一般引物越短，其Tm值也越低，反之則高。退火溫度越高，引物與模板結(jié)合的特異性增強，非特異性的擴增概率降低，但擴增效率也隨之降低。相反，隨著溫度的降低，引物與模板的非特異性結(jié)合的概率提高。退火的時間一般為30s。
③延伸（extension）：在72℃溫度下，DNA聚合酶將dNTPs連續(xù)加到引物的3'-OH端，以互補的DNA單鏈為模板，沿著模板延伸合成模板 DNA的互補鏈，稱為延伸。延伸的時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般每1kb延伸1min。
這三個過程組成一個循環(huán)周期，每個周期合成的產(chǎn)物又可作為下一個周期的模板，如此循環(huán)往復，經(jīng)過n輪循環(huán)后，靶DNA的拷貝數(shù)理論上呈2n增長。
3. PCR平臺期與平臺效應
PCR反應經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，隨著產(chǎn)物的對數(shù)累積趨于飽和，DNA片段不再呈指數(shù)積累，而是進入線性增長期或靜止期，此過程稱為平臺效應（plateau effect）。
平臺期與下列因素有關(guān)：①隨著引物、dNTP 快速摻入底物中，它們的濃度降低，摻入速度減慢；②隨產(chǎn)物增加，酶與模板的比例下降；③非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應物的競爭；④產(chǎn)物的再結(jié)合。
【分子克隆】第十四期：PCR技術(shù)（二）
PCR反應體系
PCR反應需要一定的條件才能完成，這些條件主要有以下方面：
（一）緩沖液
任何一個生化反應都必須在一定的緩沖體系中進行，緩沖體系除了提供一定的pH緩沖能力外，還有一些有助于反應進行的成分。PCR反應緩沖液通常采用10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3-9.0，室溫）緩沖液體系，其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二價陽離子，一般采用Mg2+，以MgCl2的形式提供，Mg2+的濃度高低可顯著影響 PCR擴增產(chǎn)物的特異性，此外，緩沖液中還含有50 mmol/L的K+，有利于引物與模板的退火。有些緩沖液中還加入明膠或血清白蛋白（100 μg/mL）及去污劑（如Twcen20 等），對Taq DNA聚合酶起穩(wěn)定作用。
（二）模板
PCR模板是含有待擴增序列的 DNA、mRNA或cDNA等，模板數(shù)量可直接影響擴增的效果。對于一般的 PCR擴增，104～107個模板分子可達到滿意的效果，一般宜用納克（ng）級的克隆DNA、微克（μg）水平的染色體DNA或102～105拷貝待擴增的DNA片段作為起始材料。除了數(shù)量外，模板的質(zhì)量也非常重要，不能有太多的蛋白質(zhì)和其他污染，特別是其他DNA的污染，即使是痕量的DNA，也會導致非特異性產(chǎn)物。
（三）dNTP
dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的總稱。貯備液為pH 7.0 左右，其濃度一般為20 mmol，-20℃保存。體系中為20~200 μmol即可，過低則反應速度下降，濃度過高則特異性下降，因為dNTP能絡合溶液中的Mg2+，產(chǎn)生錯配或抑制Taq DNA聚合酶活性。
（四）耐熱的DNA聚合酶
PCR反應中使用的 DNA聚合酶必須耐高溫，在90℃以上的高溫下仍能有活性，正是由于耐熱DNA聚合酶的應用才使 PCR技術(shù)得以實現(xiàn)，目前使用的耐高溫DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。
（五）引物
PCR反應的最佳條件
根據(jù)大量的研究報道，PCR反應的最佳條件為：①Taq DNA聚合酶的濃度為1.0-2.5 U/100μL反應液；②dNTP的濃度為20～200 μmol/L；③Mg2+濃度為0.5～2.5 mmol/L；④引物的濃度為0.2～1.0 μmol/L。在準備具體的PCR反應時，還要針對模板特性、PCR儀等進行上述反應體系的優(yōu)化，并設(shè)置試驗確定連退火溫度、延伸時間，建立其相應的PCR反應最優(yōu)程序。
【分子克隆】第十五期：PCR反應體系中添加劑的作用
在PCR過程中，研究人員通常會在PCR反應體系中添加二甲基亞砜DMSO，那么它究竟有什么作用呢？機理是什么呢？
通常我們可以這么理解：DMSO主要用于高GC含量的模板擴增，可能的機理是改善GC含量高的DNA的變形情況，降低其二級結(jié)構(gòu)， 使得聚合酶在二級結(jié)構(gòu)處延伸。DMSO可以提高PCR的特異性,幫助擴增一些難擴的模板。 當體系中加入DMSO時，可適當降低退火溫度。
延伸閱讀
在實踐中，聚合酶鏈式反應可能因各種原因而失敗，通常表現(xiàn)為兩個問題，一是目的模板的擴增量太少，二是非目的基因擴增太多。這種情況話，研究人員通常會在反應體系中加入合適的添加劑進行解決。通常添加劑的作用主要是降低基因的二級結(jié)構(gòu)或者降低非特異性的啟動。下面是幾種常用的添加劑以及它們的作用：
① 二甲基亞砜DMSO、非離子性洗滌劑、甜菜堿——可以降低DNA二級結(jié)構(gòu)
② 甲酰胺、四甲基氯化銨TMAC——降低非特異性啟動
③ 鎂離子——聚合酶不可缺少的一個輔因子
④ 牛血清白蛋白——減少污染物
【分子克隆】第十六期：實時定量PCR
一般而言，常規(guī)PCR很難通過基因擴增產(chǎn)物來定量該基因在模板中的表達，而實時定量PCR（real-time quantitative PCR）則可解決這一問題。所謂實時定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對模板中特定基因進行定量分析的方法。
熒光擴增曲線可以分成三個階段∶ 熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段， 擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化；在平臺期， 擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加，PCR產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，無法根據(jù)最終PCR產(chǎn)物量算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段 ，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進行定量分析。
熒光擴增曲線
實時熒光定量PCR計算步驟∶
①臨界點選擇。 臨界點是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值。它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般將臨界點缺省設(shè)置為3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍；②臨界點循環(huán)數(shù)（threshold cycle，Tc或Ct） ，PCR反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為臨界點循環(huán)數(shù)，模板的Ct值與模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越??；③標準曲線繪制。 利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可繪制標準由線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上推算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
標準曲線
熒光探針和熒光染料
探針類和非探針類實時定量PCR的化學原理有所不同。探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加；非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。
①TaqMan熒光探針 PCR擴增時在加入一對引物的同時，也加入一個特異性寡核苷酸熒光探針，其兩端分別標記了一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。在探針完整的情況下，報告基團發(fā)射的熒光信號會被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq DNA酶的5'-3'核酸外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
TaqMan熒光探針作用原理
②SYBR熒光染料 在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
SYBR熒光染料作用原理
實時熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍，運用該技術(shù)可進行基因表達、基因型鑒定、DNA或RNA的絕對定量等領(lǐng)域的分析。
