絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是在缺乏雌激素的情況下由破骨細(xì)胞過度活化引起的代謝紊亂。骨密度(BMD)降低使患者更易患髖部或椎體脆性骨折，在全球范圍內(nèi)造成嚴(yán)重殘疾和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。通過小分子激活Nrf2是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的一種很有前途的策略，然而，目前還沒有批準(zhǔn)用于治療慢性疾病的Nrf2激活劑，且Nrf2調(diào)控破骨細(xì)胞分化的下游機(jī)制仍尚不清楚。
二、 研究結(jié)果
1、Bitopertin通過與Keap1相互作用激活Nrf2，抑制Keap1介導(dǎo)的Nrf2泛素化
作者首先通過灌胃研究了bitopertin對OVX小鼠骨量的影響，發(fā)現(xiàn)bitopertin通過抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞形成來改善OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)bitopertin在抑制破骨細(xì)胞分化和減輕OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松方面具有非甘氨酸依賴性的作用。為研究bitopertin的作用靶點(diǎn)，作者對MCSF-、RANKL-和bitopertin治療的骨髓源性巨噬細(xì)胞（BMDMs）進(jìn)行了RNA測序。通過數(shù)據(jù)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證推測Nrf2可能是介導(dǎo)bitopertin作用的核心調(diào)節(jié)因子，并檢測Nrf2在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)bitopertin處理沒有改變Nrf2的mRNA表達(dá)，但蛋白水平顯著升高，而Nrf2抑制因子Keap1的表達(dá)未被bitopertin改變。體內(nèi)組織免疫熒光分析顯示，bitopertin處理小鼠股骨小梁Nrf2表達(dá)增加。通過計(jì)算機(jī)模擬分子對接分析以研究bitopertin對Keap1-Nrf2復(fù)合物的影響，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白之間的相互作用被bitopertin處理劑量依賴性地抑制。隨后，免疫共沉淀和泛素化實(shí)驗(yàn)表明bitopertin治療可減少Nrf2免疫沉淀的Keap1。Bitopertin處理后，Nrf2的泛素化水平降低，Nrf2的蛋白穩(wěn)定性增加。這些數(shù)據(jù)表明，Bitopertin通過直接結(jié)合Keap1的Kelch結(jié)構(gòu)域激活Nrf2，并降低Keap1-Nrf2相互作用。
圖1.Bitopertin通過抑制Keap1-Nrf2相互作用激活Nrf2
2、Nrf2的缺失消除了Bitopertin對破骨細(xì)胞分化和OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的影響
接下來，作者使用Nrf2-/-小鼠進(jìn)一步驗(yàn)證了Nrf2是Bitopertin的靶標(biāo)，與WT小鼠相比，bitopertin并沒有增加Nrf2-/-小鼠的骨小梁質(zhì)量、骨參數(shù)和血清CTX水平。Nrf2敲除在體外促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，bitopertin對破骨細(xì)胞的抑制作用被消除。表明bitopertin對破骨細(xì)胞分化和OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失的抑制作用是通過Nrf2激活介導(dǎo)的。接下來，作者比較了bitopertin與兩種臨床批準(zhǔn)的親電Nrf2激活劑OMA (30 mg/kg)和DMF (50 mg/kg)的療效和安全性，發(fā)現(xiàn)與DMF、OMA或bardoxolone相關(guān)的任何不良事件或嚴(yán)重不良事件的發(fā)生率顯著高于與bitopertin相關(guān)的不良事件，表明bitopertin可能是臨床使用的更安全的Nrf2激活劑候選藥。進(jìn)一步探究Nrf2抑制破骨細(xì)胞分化的下游機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Nrf2激活鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因Slc40a1的轉(zhuǎn)錄，NFE2L2（編碼Nrf2的基因）-SLC40A1軸在骨質(zhì)疏松癥患者的破骨細(xì)胞前體中受到抑制。
圖2. Nrf2的缺失消除了bitopertin對破骨細(xì)胞分化和OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的影響
3、Nrf2通過激活Slc40a1降低破骨細(xì)胞內(nèi)鐵水平
Slc40a1是哺乳動物細(xì)胞中唯一的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因。RNA-seq數(shù)據(jù)的GSEA分析顯示，在RANKL處理的Nrf2-/-和WT bmdm之間，鐵的攝取和運(yùn)輸途徑發(fā)生了顯著變化。在RANKL治療的BMDMs中，Nrf2激活劑bitopertin降低了細(xì)胞內(nèi)鐵，但在Nrf2-/- BMDMs中，這種降低是逆轉(zhuǎn)的。隨后，我們通過腺病毒shRNA敲除Slc40a1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Slc40a1沉默減弱了bitopertin的降鐵作用，表明Slc40a1是Nrf2調(diào)控破骨細(xì)胞鐵代謝的重要效應(yīng)因子。進(jìn)一步探究鐵代謝是否介導(dǎo)Nrf2對破骨細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)在OVX模型中，敲除BMDMs中的Nrf2可增加細(xì)胞內(nèi)鐵水平，激活破骨細(xì)胞分化，并加劇骨質(zhì)流失。然而，DFO螯合鐵可以逆轉(zhuǎn)Nrf2敲除引起的破骨細(xì)胞過度活化和骨質(zhì)流失。臨床數(shù)據(jù)分析表明，鐵含量過高會增加患骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險(xiǎn)。
圖3. Nrf2通過激活Slc40a1降低破骨細(xì)胞內(nèi)鐵水平
4、Nrf2和鐵調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的鳥氨酸代謝
最近的兩項(xiàng)研究表明Nrf2和鐵都可以調(diào)節(jié)核苷酸代謝，作者對DFO處理的Nrf2-/- BMDMs進(jìn)行代謝組學(xué)分析，以研究Nrf21和鐵調(diào)節(jié)的代謝途徑。代謝產(chǎn)物KEGG分析表明，精氨酸和脯氨酸代謝途徑是變化最顯著的途徑，熱圖顯示，DFO處理后，該通路中大部分差異代謝物上調(diào)。由于鳥氨酸是一種上游代謝物，可以被代謝成許多其他代謝物，作者重點(diǎn)研究了鳥氨酸，發(fā)現(xiàn)DFO處理增加了鳥氨酸的豐度，降低了亞精胺的豐度。在WT BMDMs中，用bitopertin激活Nrf2可增加細(xì)胞內(nèi)鳥氨酸水平；相反，Nrf2-/- BMDMs顯示鳥氨酸水平下降，DFO治療顯著增加了Nrf2-/- BMDMs中鳥氨酸的水平，表明鳥氨酸是受Nrf2和鐵調(diào)控的下游代謝物，影響破骨細(xì)胞分化。隨后，作者探究了Nrf2和鐵如何調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鳥氨酸水平，發(fā)現(xiàn)Nrf2-/- BMDMs抑制Odc1表達(dá)，阻止鳥氨酸向亞精胺的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致鳥氨酸水平升高，Odc1受Nrf2和鐵的調(diào)控，影響鳥氨酸代謝、破骨細(xì)胞分化和骨量。
圖4. Nrf2和鐵通過Odc1調(diào)節(jié)鳥氨酸代謝
三、 小結(jié)
本研究發(fā)現(xiàn)bitopertin通過激活Nrf2抑制破骨細(xì)胞分化并改善卵巢切除術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失。在機(jī)制上，bitopertin與Kelch結(jié)構(gòu)域相互作用，減少Keap1-Nrf2相互作用，進(jìn)而減少Nrf2降解。與現(xiàn)有的臨床Nrf2激活劑相比，bitoeprtin在人類受試者中更安全，可能是治療骨質(zhì)疏松癥和其他Nrf2相關(guān)疾病的良好候選藥物。綜上，總之，本研究確定了一種新的臨床階段Nrf2激活劑，并提出了破骨細(xì)胞中一種新的Nrf2-鐵鳥氨酸代謝軸。
*華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院李鋒教授和宋科翰博士為本文章共同通訊作者，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院董益民博士、康紅磊博士、彭仁鵬博士生為該文章的共同第一作者。
