1、PARIS與FRAP（熒光漂白恢復(fù)技術(shù)）在HEK293T細(xì)胞中的功能比較
通過(guò)對(duì)PARIS與FRAP（基于染料擴(kuò)散的方法檢測(cè)縫隙連接介導(dǎo)的光漂白后的熒光恢復(fù)）的比較發(fā)現(xiàn)，相同時(shí)間內(nèi)PARIS信號(hào)比FRAP信號(hào)更加穩(wěn)定，未曾出現(xiàn)衰減，而且PARIS信號(hào)的動(dòng)力學(xué)比FRAP快速，對(duì)應(yīng)的t1/2分別約為~21s和~197s（圖6）。
圖6. PARIS與FRAP在HEK293T細(xì)胞中的比較
2、PARIS可檢測(cè)縫隙連接和由連接蛋白編碼基因突變引起的疾病
研究表明，磷酸化通過(guò)影響縫隙連接的組裝、降解和門控等途徑參與其調(diào)節(jié)。接下來(lái)，作者探討了PARIS是否可以在蛋白磷酸化等調(diào)節(jié)條件下檢測(cè)縫隙連接：用cAMP類似物8-Br-cAMP、腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑Forskolin及蛋白激酶C（PKC）激動(dòng)劑TPA處理表達(dá)PARIS的HEK293T細(xì)胞。與對(duì)照組相比，經(jīng)TPA處理細(xì)胞后，PARIS信號(hào)受到顯著抑制，而8-Br-cAMP和Forskolin的處理對(duì)其未造成明顯影響，表明PKC的激活會(huì)抑制縫隙連接。
已知連接蛋白Cx43編碼基因GJA1的突變與許多疾病有關(guān)，那么PARIS是否可以用來(lái)檢測(cè)連接蛋白編碼基因突變引發(fā)的疾病呢？作者在不表達(dá)內(nèi)源性連接蛋白的HeLa細(xì)胞中表達(dá)了PARIS，光激活“質(zhì)子泵”細(xì)胞時(shí)，接收器細(xì)胞中未產(chǎn)生PARIS信號(hào)；而在表達(dá)GJA1的HeLa細(xì)胞中，光激活“質(zhì)子泵”細(xì)胞時(shí)，相鄰接收器細(xì)胞中產(chǎn)生了強(qiáng)烈的熒光。由于Cx43編碼基因GJA1的突變影響了縫隙連接的形成，從而使PARIS信號(hào)顯著降低。上述結(jié)果表明，PARIS可用于檢測(cè)縫隙連接蛋白編碼基因突變?cè)斐傻募膊。▓D7）。
圖7. PARIS可檢測(cè)縫隙連接和由連接蛋白基因突變引起的疾病
3、PARIS可用于報(bào)告測(cè)心肌細(xì)胞間的縫隙連接
由連接蛋白Cx40、Cx43和Cx45形成的縫隙連接在心肌細(xì)胞中起著重要作用，它們的的缺陷與心血管疾病有關(guān)。作者用培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞，光刺激“質(zhì)子泵”心肌細(xì)胞，在相鄰接收器心肌細(xì)胞中產(chǎn)生了強(qiáng)烈的熒光，并且這種熒光響應(yīng)可以被縫隙連接阻滯劑Heptanol可逆阻斷。此外，光刺激“質(zhì)子泵”心肌細(xì)胞不影響細(xì)胞中自發(fā)的鈣離子瞬變速率以及細(xì)胞搏動(dòng)的速率，說(shuō)明PARIS的表達(dá)和激活不影響細(xì)胞的功能（圖8）。
圖8. PARIS可監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞間的縫隙連接
4、PARIS可監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因果蠅特定神經(jīng)元間的縫隙連接
接著，作者檢測(cè)了PARIS是否可以用來(lái)測(cè)量腦細(xì)胞間的縫隙連接活動(dòng)（電突觸）。首先，作者在果蠅嗅覺通路的興奮性投射神經(jīng)元（ePNs）中表達(dá)了PARIS系統(tǒng)，并測(cè)量了PARIS信號(hào)，結(jié)果顯示ePNs中的自主PARIS信號(hào)可被重復(fù)誘導(dǎo)長(zhǎng)達(dá)2小時(shí)，并且信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯減弱，表明PARIS在完整的活體組織中是穩(wěn)定的。
隨后，作者利用PARIS測(cè)量了轉(zhuǎn)基因果蠅興奮性投射神經(jīng)元（ePNs）和興奮性局部神經(jīng)元（eLNs）間的電突觸——兩者在觸角葉（AL）中都有樹突狀分支：在ePNs中選擇性地表達(dá)光控質(zhì)子“泵”（GH146-QF > QUAS ArchT），在eLNs中選擇性地表達(dá)熒光傳感器（Kras-Gal4 >UAS pHluorinCAAX）。在AL中直徑為20 um的區(qū)域施加光刺激，引起了pHluorinCAAX熒光的快速增加，半上升和半衰減時(shí)間分別約為12 s和29 s，這與先前報(bào)道的電生理數(shù)據(jù)一致，表明ePNS和eLNS是電耦合的。用CBX處理轉(zhuǎn)基因蒼蠅或在突變體ShakB2果蠅大腦中（縫隙連接蛋白發(fā)生突變）并未出現(xiàn)類似熒光響應(yīng)，證實(shí)了PARIS可用來(lái)測(cè)量轉(zhuǎn)基因果蠅特定神經(jīng)元間的縫隙連接。
作者又將AL劃分為四個(gè)區(qū)域，光刺激可以誘導(dǎo)每個(gè)區(qū)域的熒光增加，表明電耦合在AL中EPNS和ELNS之間是普遍存在的（圖9）。
圖9. PARIS檢測(cè)轉(zhuǎn)基因果蠅特定神經(jīng)元間的縫隙連接
5、PARIS可報(bào)告轉(zhuǎn)基因果蠅不同神經(jīng)元結(jié)構(gòu)中的功能性縫隙連接
在果蠅嗅覺系統(tǒng)中，抑制投射神經(jīng)元（iPNs）和ePNs形成縫隙連接，參與對(duì)氣味信息的處理；并且ePNS和iPNS都有投射到AL中的樹突以及投射到側(cè)角（LH）的軸突。因此，目前尚不清楚在AL、LH或兩者中的iPNS和ePNS之間是否形成縫隙連接。
作者在iPNS中表達(dá)了光控質(zhì)子“泵”（Mz699-Gal4 > UAS ArchT），在ePNS中表達(dá)了熒光傳感器（GH146-QF > QUAS pHluorinCAAX），然后光刺激AL或LH中ePNS-iPNS重疊的區(qū)域，檢測(cè)是否存在功能性縫隙連接。結(jié)果顯示，光刺激AL，而不是LH，引起了pHluorinCAAX熒光的顯著增加，并且用CBX處理后熒光響應(yīng)被消除。上述結(jié)果表明iPNS和ePNS在AL處通過(guò)樹突-樹突接觸形成功能性縫隙連接，而不是在LH中通過(guò)軸突-軸突接觸。
圖10. PARIS監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)基因果蠅不同神經(jīng)元間的縫隙連接
作者還進(jìn)一步優(yōu)化了PARIS系統(tǒng)，通過(guò)生物信息學(xué)篩選出了比ArchT膜轉(zhuǎn)運(yùn)性能更優(yōu)異、光靈敏度更強(qiáng)（約25倍）的新質(zhì)子泵Lari，擴(kuò)展了PARIS系統(tǒng)在未來(lái)體內(nèi)應(yīng)用的前景（圖11）。
圖11. 對(duì)PARIS系統(tǒng)的進(jìn)一步優(yōu)化
