AAV在肝臟研究中的靶向策略【應(yīng)用篇】
無標(biāo)題文檔
肝臟作為較早被用于基因治療的器官，多年來研究熱度有增無減，前期小V已經(jīng)與大家共同學(xué)習(xí)了在肝臟應(yīng)用中關(guān)于AAV的選擇策略，今天小V將分享幾個(gè)利用維真生物AAV進(jìn)行肝臟研究的文獻(xiàn)案例：
01
Tripartite motif 16 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis by promoting the degradation of phospho-TAK1
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相關(guān)的肝細(xì)胞癌和肝病已成為發(fā)達(dá)國家需要肝移植的主要原因。脂質(zhì)過度積累導(dǎo)致的脂毒性能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和破壞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，在NASH中發(fā)揮核心作用。目前還沒有批準(zhǔn)任何藥物療法用于治療NASH，因此探究NASH的發(fā)展機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。
在本研究中，為了確定減輕脂毒性有害后果的關(guān)鍵分子，作者進(jìn)行了綜合多組學(xué)分析，確定了E3連接酶TRIM16為候選分子，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TRIM16在脂毒性反應(yīng)中顯著上調(diào)，并且過表達(dá)TRIM16（AAV8腹腔注射）減輕了NASH小鼠模型的脂質(zhì)積累和肝損傷。同時(shí)，作者還闡明了TRIM16調(diào)控NASH的機(jī)制，即TRIM16通過優(yōu)先與磷酸化的TGF-β活化激酶 1 (TAK1) 相互作用并通過催化K48連接的泛素化促進(jìn)其降解，來減弱絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制NASH的發(fā)展?？偟膩碚f，該研究表明TRIM16是一種特定的TAK1調(diào)節(jié)器，可以在NASH中作為潛在的治療靶標(biāo)。
圖1. TRIM16調(diào)控NASH機(jī)制
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病毒產(chǎn)品
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AAV8-CMV-TRIM16&AAV8-CMV-GFP
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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
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8周齡HFHC喂養(yǎng)C57BL/6J 小鼠（NASH小鼠模型）
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注射方式
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腹腔注射
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病毒滴度
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1x10E13vg/ml
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檢測(cè)時(shí)間
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8周后
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如圖2所示，AAV8-TRIM16注射后，Western blot和qPCR分析均表明TRIM16在小鼠肝臟中過表達(dá)成功。與對(duì)照組(AAV-GFP)相比，注射AAV8-TRIM16的小鼠在經(jīng)HFHC喂養(yǎng)16周后，肝臟重量和肝體重比明顯降低，此外，TRIM16過表達(dá)顯著減緩了HFHC喂養(yǎng)小鼠肝臟中的脂質(zhì)積聚、炎癥、纖維化和肝損傷。
圖2. AAV8過表達(dá)TRIM16可減輕HFHC喂養(yǎng)小鼠的肝脂肪變性和炎癥
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02
Overexpression of ring fnger protein 20 inhibits the progression of liver fbrosis via mediation of histone H2B lysine 120 ubiquitination
肝纖維化是一種慢性肝損傷，可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。RNF20（環(huán)指蛋白20）又稱E3泛素蛋白連接酶BRE1A，已被報(bào)道參與慢性肝病，然而，RNF20在肝纖維化中的作用尚不清楚。研究人員先后通過肝纖維化模型的體內(nèi)外研究證實(shí)，RNF20過表達(dá)可顯著抑制體內(nèi)外肝纖維化的進(jìn)展，表明RNF20有望成為治療肝纖維化的新靶點(diǎn)。
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病毒產(chǎn)品
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AAV8-TBG-RNF20
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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
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C57BL/6J小鼠
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注射方式
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尾靜脈注射
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病毒滴度
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7.94×10E13 vg/ml
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注射量
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1×10E9pfu/mouse
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檢測(cè)時(shí)間
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8周后
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為探究RNF20在肝纖維化中的作用，研究人員建立了活體肝纖維化模型，如圖3所示，使用AAV8過表達(dá)RNF20顯著逆轉(zhuǎn)了小鼠肝組織中由CCl4引起的炎性浸潤和膠原體積，同時(shí)逆轉(zhuǎn)CCl4導(dǎo)致的α-SMA的表達(dá)增加和H2BK120ub蛋白水平的降低，這些結(jié)果表明，RNF20過表達(dá)可明顯減輕體內(nèi)肝纖維化癥狀。
圖3. RNF20過表達(dá)可明顯緩解體內(nèi)肝纖維化癥狀
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03
PSMP/MSMP promotes hepatic fibrosis through CCR2 and represents a novel therapeutic target
肝纖維化是一種慢性肝損傷的傷口愈合反應(yīng)，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在肝臟過度沉積，最終導(dǎo)致肝功能喪失和肝臟結(jié)構(gòu)破壞。研究表明，趨化因子受體系統(tǒng)在肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，C-C基序趨化因子受體2(CCR2)被認(rèn)為是治療肝纖維化很有前景的一個(gè)靶點(diǎn)。PC3分泌微蛋白(PSMP)/微精原蛋白(MSMP)是一種新型的趨化細(xì)胞因子，作為CCR2配體可以募集外周血單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，可能影響炎癥和癌癥的發(fā)展。
首先，研究者通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)了不同肝臟疾病組織中的PSMP水平，發(fā)現(xiàn)PSMP在肝纖維化患者肝組織中表達(dá)較高。接著，構(gòu)建了PSMP敲除小鼠（PSMP-/-小鼠）,發(fā)現(xiàn)PSMP-/-小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平明顯降低，肝損傷得到改善。利用AAV8載體在PSMP-/-小鼠過表達(dá)hPSMP，發(fā)現(xiàn)肝損傷和纖維化顯著加重；并通過構(gòu)建PSMP和CCR2雙敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)PSMP過表達(dá)以CCR2依賴的方式促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。作者揭示了PSMP通過促進(jìn)炎癥巨噬細(xì)胞浸潤、M1極化、促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生以及通過CCR2直接激活肝星狀細(xì)胞進(jìn)而加速肝纖維化，提出PSMP可能是一個(gè)潛在的肝纖維化治療靶點(diǎn)，其抗體可能是治療肝纖維化的潛在藥物。
圖4. PSMP/MSMP通過CCR2促進(jìn)肝纖維化
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基因信息
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hPSMP（人類PC3分泌型微蛋白，一種新型的趨化細(xì)胞因子，受體為CCR2）
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病毒產(chǎn)品
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AAV8-hPSMP&AAV8-null
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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
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6-8周齡C57BL/6J雄性小鼠
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注射方式
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尾靜脈注射
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注射劑量
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100μL，2×10E11vg
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檢測(cè)時(shí)間
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8周后
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通過尾靜脈注射AAV8-hPSMP后，PSMP-/-小鼠肝臟PSMP表達(dá)量顯著升高，注射4周后PSMP依舊有較高的表達(dá)。接著再用CCl4處理以誘導(dǎo)肝纖維化，發(fā)現(xiàn)PSMP過表達(dá)引起的肝損傷和纖維化顯著加重，并通過構(gòu)建PSMP和CCR2雙敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)PSMP過表達(dá)以CCR2依賴的方式促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。
圖5. AAV8過表達(dá)PSMP對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的影響
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04
Hepatic neddylation targets and stabilizes electron transfer flavoproteins to facilitate fatty acid β-oxidation
類泛素化修飾（Neddylation）是一種通過將NEDD8與特定底物蛋白中的賴氨酸共價(jià)結(jié)合，控制細(xì)胞的生存和增殖的泛素化樣途徑。但是，類泛素化在哺乳動(dòng)物代謝中的生理作用尚不明確，也沒有明確的線粒體靶點(diǎn)。肝臟特異性UBA3缺乏會(huì)導(dǎo)致類似戊二酸尿癥II型（GA-II）的系統(tǒng)性異常，GA-II是一種罕見的常染色體隱性遺傳性脂肪酸氧化障礙疾病，由線粒體電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白（ETF:ETFA和ETFB）或相應(yīng)的泛醌氧化還原酶缺陷引起。然而ETFA和ETFB蛋白水平在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。
在本研究中，作者構(gòu)建的肝臟特異性UBA3和NEDD8缺失的小鼠模型，表現(xiàn)出自發(fā)性脂肪肝和肝細(xì)胞衰老的新生兒死亡，并伴有肝臟脂肪酸-β氧化缺陷；成年小鼠中UBA3的特異性缺失（通過AAV-DJ進(jìn)行尾靜脈注射）導(dǎo)致ETF蛋白的減少，并增加禁食誘導(dǎo)的脂肪變性和死亡率。IB和IF分析發(fā)現(xiàn)新生小鼠線粒體蛋白也發(fā)生類泛素化，免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)ETF蛋白為類泛素化的底物。此外，ETF基因突變導(dǎo)致類泛素化修飾缺陷，促進(jìn)了GA-II的發(fā)病。本研究表明類泛素化修飾是一種可以通過阻斷肝細(xì)胞內(nèi)ETFs的泛素化和降解來靶向并穩(wěn)定ETFs的泛素化樣修飾途徑，肝類泛素化可防止新生小鼠出現(xiàn)GA-II類異常，降低成年小鼠因禁食引起的死亡率。
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病毒產(chǎn)品
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AAV-DJ-CAG-Cre
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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
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8周齡C57BL/6J雄性小鼠
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注射方式
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尾靜脈注射
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注射量
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20 μL
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病毒滴度
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3.0×10E13vg/ml
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檢測(cè)時(shí)間
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6周后
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如圖6A所示，研究人員將AAV-DJ-CAG-Cre通過尾靜脈注射至8周齡雄性Uba3F/F和同窩Uba3F/+ 小鼠體內(nèi)，IB分析證實(shí)Uba3F/F小鼠肝臟中UBA3缺失，但心臟和腎臟中沒有，證明肝臟特異性UBA3缺失小鼠模型構(gòu)建成功。經(jīng)AAV-DJ-Cre轉(zhuǎn)導(dǎo)后，Uba3F/F小鼠和Nedd8F/F小鼠肝臟中UBA3、Nedd8的缺失導(dǎo)致ETFs蛋白表達(dá)水平的顯著下降；對(duì)小鼠進(jìn)行禁食處理，研究者發(fā)現(xiàn)UBA3、Nedd8的缺失導(dǎo)致小鼠肝臟脂質(zhì)儲(chǔ)存和死亡率增加，表明成年小鼠肝臟中的類泛素化/ETF軸可以預(yù)防禁食誘導(dǎo)的脂肪變性和死亡率。
圖6A. 構(gòu)建肝臟特異性UBA3缺失小鼠模型
圖6B. 類泛素化/ETF軸可以預(yù)防成年小鼠肝臟中由禁食誘導(dǎo)的脂肪變性和死亡率
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05
Suppression of YAP/TAZ-Notch1-NICD axis by bromodomain and extraterminal protein inhibition impairs liver regeneration
肝臟有很強(qiáng)的再生能力，許多肝臟疾病的治療都是通過有效的肝再生來調(diào)節(jié)的。但是，調(diào)控肝再生的生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。研究表明，溴域和末端外結(jié)構(gòu)域(BET)蛋白及其抑制劑與肝癌密切相關(guān)，此外BET蛋白在斑馬魚的肝再生過程中至關(guān)重要，但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。Hippo-YAP/TAZ通路已被證實(shí)是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和器官大小的關(guān)鍵因子，在多種肝疾病中處于激活狀態(tài)，但其是否參與肝再生過程也尚不明確。
在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)BET蛋白抑制劑JQ1顯著抑制70%肝臟切除術(shù)（PH）后的肝再生，并且JQ1可以抑制肝臟細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)JQ1在mRNA和蛋白水平抑制體內(nèi)肝再生過程YAP/YAZ和Notch信號(hào)通路的表達(dá)，而YAP/TAZ抑制劑顯著下調(diào)了YAP、TAZ和Notch信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，并抑制70%PH后肝再生。接著利用AML12-Yap-shRNA細(xì)胞系證明了JQ1可以通過抑制AML12細(xì)胞YAP的表達(dá)，間接下調(diào)Notch信號(hào)通路的活性，下游分子Notch1被證明是YAP/TAZ的功能靶標(biāo)。最后發(fā)現(xiàn)通過過表達(dá)YAP可以補(bǔ)救BET蛋白抑制劑引起的肝再生損傷，揭示了YAP/TAZ–Notch1–NICD在肝再生中的功能以及BET蛋白抑制劑（如JQ1）在肝臟疾病治療中的風(fēng)險(xiǎn)。
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基因信息
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YAP（Hippo/Yes-associated protein，Hippo/Yes相關(guān)蛋白，被認(rèn)為是調(diào)控肝臟大小的重要因子）
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病毒產(chǎn)品
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AAV9-CMV-YAP
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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
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6周齡C57BL/6J雄性小鼠
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注射方式
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腹腔注射
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注射劑量
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1×10E11 vg/mice
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檢測(cè)時(shí)間
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4周后
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腹腔注射表達(dá)YAP的AAV9過表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)YAP顯著高表達(dá)。與YAP非過表達(dá)組相比，YAP過表達(dá)后小鼠LW/BW比、肝再生的兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Hgf和Vegf表達(dá)水平及Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白（Jagged1, Notch1和NICD）表達(dá)水平均明顯升高。不僅如此，Ki-67（細(xì)胞增殖指數(shù)）陽性肝細(xì)胞數(shù)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于YAP非過表達(dá)組。這些數(shù)據(jù)說明，小鼠肝臟中YAP的過表達(dá)可以挽救BET蛋白抑制劑對(duì)肝再生的損傷。
圖7. AAV9過表達(dá)Yap可補(bǔ)救BET蛋白抑制劑引起的肝再生損傷
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