AAV在胰腺研究中的靶向策略（干貨&應(yīng)用合集）
胰腺是重要的分泌器官，由外分泌組織(腺泡)、內(nèi)分泌組織(胰島)、胰管和血管組成，這些結(jié)構(gòu)的功能障礙會(huì)導(dǎo)致不同的胰腺疾病發(fā)生。鑒于胰腺的解剖位置和復(fù)雜結(jié)構(gòu)，胰腺疾病的基因治療需要針對(duì)不同胰腺部位進(jìn)行有效的基因傳遞。多項(xiàng)研究表明，相比腺病毒和慢病毒而言，腺相關(guān)病毒更能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)胰腺，已作為一種明星載體在胰腺研究中展開應(yīng)用。今天小V就帶大家一起學(xué)習(xí)一下rAAV在胰腺基因工程中的選擇策略。
一、血清型的選擇
研究表明AAV8在胰腺中具有相對(duì)較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
Cheng H等研究證明，AAV8對(duì)胰腺的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率優(yōu)于AAV1、AAV2、AAV5血清型，且持續(xù)表達(dá)時(shí)間較長（圖1）；進(jìn)一步通過胰腺導(dǎo)管給藥觀察不同血清型的組織分布發(fā)現(xiàn)AAV8可以高效轉(zhuǎn)導(dǎo)胰腺組織（圖2），并且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率呈劑量依賴式增加（圖3）。
圖1.不同AAV血清型和慢病毒對(duì)胰腺的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比較
病毒：ssAAV1、2、5、8，LV
啟動(dòng)子：CMV
注射量：AAV：1011 VP；LV：1.5×107 IU
注射方法：胰腺導(dǎo)管給藥
（Cheng, H., et al. J Biomed Sci, 2007.）
圖2. 不同血清型AAV經(jīng)胰腺局部給藥后的組織分布
病毒：ssAAV1、2、5、8
啟動(dòng)子：CMV
注射量：1011 VP
注射方法：胰腺導(dǎo)管給藥
（Cheng, H., et al. J Biomed Sci, 2007.）
圖3. AAV1和AAV8對(duì)胰腺轉(zhuǎn)導(dǎo)的劑量反應(yīng)
病毒：ssAAV1、8
啟動(dòng)子：CMV
注射量：108-1011 VP
注射方法：胰腺導(dǎo)管給藥
· 維真AAV8感染小鼠胰腺效果圖 ·
（Insulin：紅色熒光 GFP：綠色熒光）
病毒產(chǎn)品：AAV8-insulin-GFP
病毒用量：1012 vg
注射方法：膽總管(十二指腸壺腹開口處)
二、AAV載體的選擇
研究表明scAAV對(duì)胰腺的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也較高，且不同血清型轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與給藥方式、啟動(dòng)子和注射量等密切相關(guān)。體外感染分離的胰島時(shí)，scAAV6的感染能力強(qiáng)于scAAV1、scAAV2和scAAV8；通過全身給藥時(shí)（腹腔體內(nèi)注射），scAAV8比scAAV6轉(zhuǎn)導(dǎo)效率強(qiáng)（圖5）；而通過胰腺導(dǎo)管給藥時(shí)，scAAV6強(qiáng)于scAAV8、9，可以有效轉(zhuǎn)導(dǎo)腺泡、導(dǎo)管、胰島在內(nèi)的多種胰腺細(xì)胞（圖6）。
圖5.不同血清型dsAAV-CB-GFP載體對(duì)體外胰島和體內(nèi)胰腺的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比較
病毒：scAAV1、2、5、6、8
啟動(dòng)子：CB
注射量：5×1011VG
注射方法：腹腔注射
（Wang, Z., et al. Diabetes, 2006.）
圖6.胰腺導(dǎo)管給藥時(shí)，scAAV6轉(zhuǎn)導(dǎo)效率強(qiáng)于scAAV8、9
病毒：scAAV6、8、9
啟動(dòng)子：EF1α
注射量：1×1011VG
注射方法：胰腺導(dǎo)管給藥
（Quirin, K.A., et al.Mol Ther Methods Clin Dev, 2018.）
三、啟動(dòng)子的選擇
為了在胰腺特定細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，可以選擇胰腺組織特異性啟動(dòng)子，目前文獻(xiàn)中推薦的啟動(dòng)子是胰腺β細(xì)胞特異性啟動(dòng)子Insulin和PDX1，可以有效介導(dǎo)基因在胰腺β細(xì)胞的特異表達(dá)。
四、注射方式的選擇
在胰腺研究中，常用的給藥方有腹腔注射、靜脈注射和胰腺導(dǎo)管內(nèi)注射。不同給藥方式會(huì)影響AAV載體對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。研究表明，與導(dǎo)管內(nèi)給藥相比，ssAAV8和ssAAV9載體對(duì)胰腺的系統(tǒng)性給藥會(huì)導(dǎo)致其轉(zhuǎn)導(dǎo)率降低.（參考文獻(xiàn)“Safety and Efficacy of AAV Retrograde Pancreatic D)
因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的注射方式十分重要。系統(tǒng)性給藥方式（腹腔注射和靜脈注射）的操作方式不再贅述，在此介紹一下胰腺導(dǎo)管內(nèi)注射的操作方式（僅供參考）:
1、將小鼠進(jìn)行麻醉后手術(shù)打開其腹腔，在膽囊底部切一小口，將特定的導(dǎo)管插入膽囊管中；
2、將導(dǎo)管置入總膽管，并在膽管和導(dǎo)管周圍用微鉗夾固定，以防止載體反流進(jìn)入肝臟；
3、將微鉗夾置于Oddi括約肌上，避免載體漏入十二指腸，將100μl AAV載體通過導(dǎo)管緩慢注入胰管，腺體均勻腫脹則證明給藥成功；
4、灌注5min后取下上述兩個(gè)微鉗夾；
5、取出導(dǎo)管，手術(shù)縫合小鼠腹腔傷口。
6、術(shù)后，將小鼠放置在加熱墊上待其恢復(fù)后放回籠子。
· 總結(jié) ·
在胰腺研究中，不同AAV血清型轉(zhuǎn)導(dǎo)效率與AAV載體選擇、啟動(dòng)子以及給藥方式等因素密切相關(guān)：
①通過胰腺導(dǎo)管給藥方式，ssAAV8比ssAAV1、ssAAV2、ssAAV5轉(zhuǎn)導(dǎo)效率強(qiáng)；
②通過全身給藥，scAAV8比scAAV6轉(zhuǎn)導(dǎo)效率強(qiáng)；通過胰腺導(dǎo)管給藥方式時(shí)，scAAV6強(qiáng)于scAAV8、9；
③ssAAV8、9經(jīng)胰腺導(dǎo)管給藥比經(jīng)全身給藥轉(zhuǎn)導(dǎo)效率強(qiáng)。
小V建議您實(shí)驗(yàn)前根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康木C合選擇合適的載體、血清型、啟動(dòng)子和注射方式，以實(shí)現(xiàn)基因的高效長久表達(dá)。
客戶案例分享1
“Autotaxin signaling facilitates b cell dedifferentiation and dysfunction induced by Sirtuin 3 deficiency”（IF=6.448）
外周組織β細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗是2型糖尿?。═2D）的主要病理生理學(xué)特征。β細(xì)胞去分化是導(dǎo)致β細(xì)胞功能缺陷進(jìn)而促進(jìn)T2D進(jìn)展的因素之一。研究表明，控制β細(xì)胞去分化可作為改善β細(xì)胞功能的一種潛在治療策略。此外，多項(xiàng)研究證實(shí)胰島中SIRT3蛋白的表達(dá)與β細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。
先前的研究已發(fā)現(xiàn)，β細(xì)胞Sirt3特異性敲除的小鼠在HFD喂食后，糖耐量和胰島素分泌受損；胰島Sirt3缺失后Enpp2（又稱ATX）蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Enpp2/ATX是一種具有溶血磷脂酶活性的分泌酶，可產(chǎn)生溶血磷脂酸(LPA)。在此研究中，作者假設(shè)ATX/LPA通路的激活促進(jìn)了Sirt3缺陷β細(xì)胞的去分化，并將LPA或LPC（ATX可將其水解產(chǎn)生LPA）應(yīng)用于Sirt3缺失的MIN6細(xì)胞系和小鼠胰島，以研究LPA對(duì)β細(xì)胞去分化的影響及其潛在機(jī)制。
研究顯示在Sirt3缺失的MIN6細(xì)胞和小鼠胰島中，ATX表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致LPC增加，進(jìn)而使LPA產(chǎn)生增加。LPA的增加不僅誘導(dǎo)了MIN6細(xì)胞和小鼠胰島的可逆去分化，而且還減少了葡萄糖刺激的胰島素分泌。機(jī)制上，ATX/LPA通過誘導(dǎo)JNK/p38 MAPK磷酸化促進(jìn)β細(xì)胞脫分化。使用AAV8體內(nèi)抑制ATX（AAV8-Atx-shRNA）可以改善HFD喂養(yǎng)的Sirt3缺失小鼠的胰島素分泌并減少β細(xì)胞的去分化。
圖7. Sirt3-ATX/LPA通路在胰腺β細(xì)胞去分化中的作用機(jī)制
基因信息：Atx，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶蛋白家族成員
病毒產(chǎn)品：AAV8-Atx-shRNA、AAV8-scramble（insulin 1啟動(dòng)子）
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡雄性小鼠
注射方式：腹腔注射
注射量：1×1012 genome copies
注射體積：100 μL
研究者使用腺相關(guān)病毒載體AAV8選擇性抑制了ATX在正常小鼠和Sirt3 f/f;Cre/+小鼠胰島中的表達(dá)。病毒注射8周后，進(jìn)行6周的HFD喂食。胰島ATX蛋白水平的降低證明了AAV8病毒的有效傳遞。隨后的多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)測試表明胰臟β細(xì)胞中ATX的敲低不僅可以挽救HFD誘導(dǎo)的葡萄糖耐受不良，恢復(fù)胰島素的分泌，還減弱了HFD誘導(dǎo)的Sirt3 f/f;Cre/+小鼠中JNK/p38 MAPK信號(hào)的激活，抑制β細(xì)胞的去分化。這些結(jié)果證實(shí)了ATX在體內(nèi)對(duì)β細(xì)胞去分化的病理作用。
圖8. Sirt3 f/f;Cre/+小鼠ATX的特異性敲低改善了HFD誘導(dǎo)的葡萄糖耐受不良
圖9. Sirt3 f/f;Cre/+小鼠ATX的特異性敲低改善了HFD誘導(dǎo)的β細(xì)胞去分化
案例分享2
“HRD1 an important player in pancreatic β-cell failure and therapeutic target for type 2 diabetic mice”（IF=9.461）
2型糖尿病(T2D)是一種以血糖持續(xù)升高為特征的慢性代謝性疾病，研究報(bào)道胰臟β細(xì)胞衰竭導(dǎo)致的胰島素分泌不足與T2D的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HRD1 (HMG-CoA reductase degradation 1)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)E3泛素連接酶的代表，通過靶向并有效降解錯(cuò)誤折疊的胰島素原維持胰島β細(xì)胞的功能，HRD1的缺失會(huì)導(dǎo)致胰島素分泌（GSIS）受損。研究報(bào)道HRD1在 Akita糖尿病小鼠胰島中表達(dá)上調(diào)。NCBI GEO數(shù)據(jù)庫的基因組數(shù)據(jù)顯示，T2D患者胰島細(xì)胞HRD1 mRNA水平升高。然而，HRD1在胰島β細(xì)胞中的特異性病理作用仍不明確。
大量的β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子在成熟β細(xì)胞功能的維持中起著至關(guān)重要的作用，其中，轉(zhuǎn)錄因子v-maf 肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A（MafA）僅在胰腺β細(xì)胞中表達(dá)，是β細(xì)胞形成和功能所需的關(guān)鍵因子。盡管泛素誘導(dǎo)的降解是糖尿病條件下β細(xì)胞中MafA減少的主要原因，但E3泛素連接酶在調(diào)節(jié)MafA活性中的具體作用仍有待探索。
在本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)HRD1在T2D病人和T2D小鼠胰島中過度表達(dá)。功能研究表明，β細(xì)胞HRD1的特異性過表達(dá)引發(fā)了胰島素分泌受損，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的高血糖;相反，在糖尿病模型中，HRD1基因的下調(diào)改善了血糖控制和反應(yīng)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明HRD1與β細(xì)胞功能調(diào)控因子MafA可能存在相互作用。機(jī)制上，HRD1作為E3泛素連接酶，在糖尿病β細(xì)胞中靶向MafA的泛素化和降解，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中MafA的積累，并降低其在細(xì)胞核中的生物功能，進(jìn)一步導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙。本研究揭示了HRD1可作為2型糖尿病的治療靶點(diǎn)，確立了靶向HRD1對(duì)T2D治療的重要性。
基因信息：HRD1
病毒產(chǎn)品：AAV8-MIP–shHRD1–GFP、AAV8-MIP-HRD1-GFP、AAV8-GFP-control
病毒滴度：1012 GCP/mL
注射方式：胰腺導(dǎo)管內(nèi)注射，6 μl/min
研究人員通過胰腺導(dǎo)管給藥AAV8-MIP-shHRD1-GFP，注射入雄性C57BL / 6J小鼠胰腺導(dǎo)管，特異性敲低小鼠β細(xì)胞中的HRD1，免疫熒光證實(shí)了AAV載體在體內(nèi)的有效傳遞（圖10）。
圖10. 胰腺導(dǎo)管給藥AAV在體內(nèi)的有效傳遞
隨后作者將AAV8-MIP-shHRD1注射入HFD飼喂的糖尿病小鼠胰腺導(dǎo)管，2周后，糖尿病小鼠空腹血糖明顯下降。4周后，糖耐量試驗(yàn)（Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT）結(jié)果顯示糖尿病小鼠血糖反應(yīng)和血清胰島素水平明顯改善。AAV-shHRD1注射db/db小鼠的葡萄糖反應(yīng)也有改善。綜上結(jié)果表明HRD1在胰島β細(xì)胞功能障礙和糖尿病中發(fā)揮重要作用。
圖11. 抑制HRD1可改善糖尿病小鼠高血糖和葡萄糖耐受不良
研究人員通過胰腺導(dǎo)管內(nèi)注射AAV8-MIP-HRD1，注射后胰島HRD1蛋白水平明顯升高，小鼠的空腹血糖和復(fù)餐血糖水平顯著升高，獲得β細(xì)胞HRD1特異性過表達(dá)小鼠。IPGTT結(jié)果顯示糖代謝嚴(yán)重受損，HRD1特異性過表達(dá)的小鼠血漿胰島素水平表現(xiàn)紊亂。上述結(jié)果表明β細(xì)胞HRD1上調(diào)可誘發(fā)高血糖并損傷胰島素的分泌。
圖12. HRD1過表達(dá)引發(fā)高血糖和葡萄糖耐受不良
案例分享 3
“Inhibition of miR-155 reduces impaired autophagy and improves prognosis in an experimental pancreatitis mouse model”（IF=8.469）
急性胰腺炎（AP）是一種胰腺炎癥疾病，其特征是蛋白酶異常激活、實(shí)質(zhì)損傷、胰腺自消化、腺泡細(xì)胞凋亡和壞死以及強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。AP的早期階段，胰腺的損傷和炎癥會(huì)引起全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），可導(dǎo)致單個(gè)或多個(gè)器官衰竭，這也正是AP早期發(fā)病和死亡的主要原因。然而，AP引起的器官衰竭的病理機(jī)制還尚未闡明。
MiR-155是一種在炎癥反應(yīng)促進(jìn)和抗炎通路激活抑制中發(fā)揮重要作用的miRNA，已有研究表明，miR155在胰腺炎樣本中表達(dá)上調(diào)。已知自噬受損可促進(jìn)酶原激活、腺泡細(xì)胞分泌異常、細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)進(jìn)而加重AP；此外，有研究表明miR-155在多種疾病中促進(jìn)自噬。本研究旨在通過調(diào)節(jié)自噬探究miR-155對(duì)AP病程的影響。
基因信息：miR-155
病毒產(chǎn)品：AAV9-miR-155、AAV9-miR-155 sponge
注射體積：病毒稀釋液50 μL
注射方式：尾靜脈注射
檢測時(shí)間：注射3周后
首先，本研究構(gòu)建了AP小鼠模型，利用AAV9載體介導(dǎo)miR-155和miR-155 sponge在AP小鼠胰腺中進(jìn)行有效傳遞，發(fā)現(xiàn)miR-155靶蛋白TAB2的表達(dá)受到明顯調(diào)控。此外，miR-155表達(dá)的調(diào)節(jié)可以影響蛙皮素誘導(dǎo)的AP嚴(yán)重程度，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉默miR-155可以抑制不能與溶酶體融合的自噬小體的積累，并通過靶向TAB2減少胰腺炎癥，從而改善AP模型小鼠的胰腺和肺損傷。此外，自噬抑制劑3-MA可以減少自噬小體的異常積累，從而減輕因miR-155水平升高而加重的胰腺損傷。本研究表明調(diào)節(jié)miR-155的表達(dá)可能是治療或預(yù)防胰腺炎的一種潛在策略。
圖13. AP中miR-155和自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制
研究者通過小鼠尾靜脈注射AAV介導(dǎo)的miR-155和miR-155 sponge，3周后檢測miR-155的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)AAV9介導(dǎo)的miR-155在胰腺中有效傳遞，并且高滴度的AAV9對(duì)miR-155的表達(dá)影響更為顯著（圖14）。
圖14. AAV9介導(dǎo)的miR-155在胰腺中有效傳遞
進(jìn)一步研究miR-155的調(diào)控對(duì)蛙皮素誘導(dǎo)的AP程度影響，通過胰腺水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、腺泡細(xì)胞的病理改變以及淀粉酶和脂肪酶水平，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-155可以加重蛙皮素誘導(dǎo)的AP嚴(yán)重程度，而下調(diào)miR-155可能對(duì)實(shí)驗(yàn)性胰腺炎具有保護(hù)作用。
圖15. miR-155表達(dá)的調(diào)控影響蛙皮素誘導(dǎo)的AP嚴(yán)重程度
