『AAV-骨骼系統(tǒng)』如何實現(xiàn)外源基因在骨骼系統(tǒng)的高效表達？
骨骼存在于人和動物體內(nèi)，為肌肉、肌腱和韌帶提供了附著點，從而使運動成為可能。骨骼細胞譜系涵蓋了在穩(wěn)態(tài)和損傷期間分別維持和修復(fù)骨骼的多種細胞，包括成骨細胞、骨細胞和軟骨細胞，這些骨骼細胞類型主要參與骨骼和軟骨的形成，而負責骨骼吸收的破骨細胞則來自造血譜系。通過成骨細胞和破骨細胞活性之間的平衡來維持正常的骨穩(wěn)態(tài)。骨骼系統(tǒng)通過其支撐身體、保護內(nèi)臟器官、參與運動功能、造血功能以及調(diào)節(jié)礦物質(zhì)平衡等主要作用來維持身體健康，但由于多種因素的相互作用，機體功能易出現(xiàn)退化，容易導(dǎo)致骨骼疾病的發(fā)生，對人們的生活造成諸多困擾。
AAV憑借安全性高、免疫原性低、宿主范圍廣及表達穩(wěn)定等特點，被視為最有前途的基因轉(zhuǎn)移載體之一，目前已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的基因治療。本期我們將和大家一起學(xué)習(xí)AAV在骨骼系統(tǒng)中的應(yīng)用方法。
溫馨提示：以上來自于文獻報道，AAV在骨骼系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率應(yīng)結(jié)合血清型、啟動子及注射方式等多方面綜合考慮，建議在進行實驗前根據(jù)具體想要感染的組織細胞查閱相關(guān)文獻并進行預(yù)實驗的摸索。
一. AAV血清型
案例 1
研究團隊評估了在體外不同AAV血清型對小鼠顱骨成骨細胞（COB）、骨髓衍生的破骨細胞前體（BM-OCP）和軟骨細胞祖細胞（ATDC5）的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，發(fā)現(xiàn)rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7，rAAV9，rAAVrh.10和rAAVrh.39這八種AAV載體能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)COB。其中，rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7和rAAV9也能轉(zhuǎn)導(dǎo)BM-OCP，而rAAV1，rAAV6，rAAVrh.10和rAAVrh.39則能轉(zhuǎn)導(dǎo)ATDC5；此外，rAAV2和rAAV6.2實現(xiàn)了ATDC5細胞的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)，但在COB中轉(zhuǎn)導(dǎo)效果較差。接著，將體外篩選出的八種血清型AAV通過關(guān)節(jié)腔注射到2月齡小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)僅AAV9能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)成骨細胞、破骨細胞和骨細胞等。
（Yang YS, et al. Nat Commun.2019）
案例 2
通過膝關(guān)節(jié)注射不同AAV血清型（AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 6.2, rh8, rh10, rh39, rh43）至不同樣本軟骨組織中，發(fā)現(xiàn)與其他AAV血清型相比，AAV2和AAV6.2在體內(nèi)外軟骨細胞的基因遞送中均表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
不同AAV血清型在小鼠軟骨組織中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比較
（Dong Suk Yoon,et al. Int. J. Med. Sci. 2021）
二. 啟動子
為增強AAV對骨骼系統(tǒng)的特異性靶向，除了可以選擇CMV等廣譜啟動子外，還有多種骨骼特異性啟動子：
體內(nèi)用于靶向成骨細胞和骨細胞的啟動子概述
（Kitase Y, Prideaux M. Bone. 2023）
在CAG、Col2.3和Sp7三種啟動子的驅(qū)動下，將AAV8-tdTomato（5×1011vg）經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，檢測發(fā)現(xiàn)三種構(gòu)建體均成功轉(zhuǎn)導(dǎo)脛骨細胞；值得注意的是，骨特異性啟動子Col2.3和Sp7驅(qū)動的tdTomato表達與成骨細胞標記物AP共定位且轉(zhuǎn)導(dǎo)水平相似。其中Col2.3介導(dǎo)骨膜和成骨細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Sp7主要介導(dǎo)成骨細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
全身給藥后，攜帶骨細胞特異性啟動子的AAV8選擇性靶向成骨細胞
（ Lee, Lucinda R. , et al. Methods, Clinical Development. 2019）
三. 注射方式
針對骨骼系統(tǒng)的AAV注射方式可分為三種：針對骨骼系統(tǒng)特異性的骨關(guān)節(jié)腔注射、靜脈注射以及針對骨髓的骨內(nèi)注射。關(guān)節(jié)腔注射（Intra-Articular Injection）是首選的給藥方法。與全身給藥相比，關(guān)節(jié)內(nèi)注射降低了非靶器官發(fā)生不良事件的可能性，提高了治療藥物在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的有效濃度，并且降低了成本。通過該注射方式給藥AAV可以將基因高效的傳遞至關(guān)節(jié)，滑膜中的成纖維樣滑膜細胞（FLS）、巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞和T細胞等均可被有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。
操作步驟（以膝關(guān)節(jié)注射為例）：
1) 抓握固定小鼠，對膝關(guān)節(jié)作備皮處理；
2) 用75％乙醇消毒后，握緊小鼠下肢，屈曲60°；
3) 取微量注射器于髕骨下方腱外緣進針，稍向內(nèi)下穿過關(guān)節(jié)囊后即感到有落空感，此時不再進針并緩慢注射，注射完畢后靜置10s；
4) 旋轉(zhuǎn)拔出注射器，對注射位置作75％乙醇消毒處理。
小鼠膝關(guān)節(jié)注射示意圖
（https://www.clodrosome.com/animal-injection/）
四. 客戶案例
骨關(guān)節(jié)炎 / 案例1
文章標題：CircSERPINE2 protects against osteoarthritis by targeting miR-1271 and ETS-related gene
發(fā)表期刊：Annals of the Rheumatic Diseases (IF 27.973)
合作客戶：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院范順武教授團隊
CircSERPINE2過表達可緩解OA兔的癥狀
研究團隊將AAV-CircSERPINE2-wt或AAV-CircSERPINE2-mut通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射入前交叉韌帶橫切(ACLT)誘導(dǎo)的OA兔體內(nèi)。結(jié)果顯示OA兔在注射AAV-CircSERPINE2-wt后軟骨表面得到了改善，AAV-CircSERPINE2-mut組則無改善。OARSI評分顯示，AAV-CircSERPINE2-wt顯著降低了OARSI評分，而AAV-CircSERPINE2-mut則提高了OARSI評分；顯微CT圖像顯示OA兔骨贅增加，注射AAV-CircSERPINE2后骨贅減少。免疫組化和WB分析顯示，注射AAV-CircSERPINE2-wt減輕兔OA模型軟骨基質(zhì)的退行性變化，如細胞凋亡增強和分解代謝反應(yīng)增強，ECM組成增加。
骨關(guān)節(jié)炎 / 案例2
文章標題：IRF1 regulation of ZBP1 links mitochondrial DNA and chondrocyte damage in osteoarthritis
發(fā)表期刊：Cell Communication and Signaling (IF 8.2)
合作客戶：華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院祝文濤教授團隊
ZBP1對DMM小鼠的OA進展至關(guān)重要
為評估軟骨細胞中ZBP1的缺失是否能保護小鼠免受OA侵害，研究團隊將AAV9-shZBP1注射到小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，IHC結(jié)果證實，與AAV9-shGFP組相比，AAV9-shZBP1有效減少了ZBP1-軟骨細胞數(shù)量。在首次注射AAV9兩周后，進行DMM手術(shù)或假手術(shù)，并在術(shù)后第56天處死小鼠。與DMM組相比，AAV9-shZBP1組小鼠關(guān)節(jié)軟骨退化較少，OARSI評分較低。通過評估四組軟骨下骨和骨贅的變化，發(fā)現(xiàn)接受DMM手術(shù)的AAV9-shZBP1注射小鼠骨贅形成減少，骨贅評分降低。上述結(jié)果表明，軟骨中ZBP1的下調(diào)保護了小鼠免受DMM誘導(dǎo)的軟骨退化和骨贅形成的影響。
骨關(guān)節(jié)炎 / 案例3
文章標題：JNK-JUN-NCOA4 axis contributes to chondrocyte ferroptosis and aggravates osteoarthritis via ferritinophagy
發(fā)表期刊：Free Radical Biology and Medicine (IF 8.101)
合作客戶：華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院郭風勁教授團隊
NCOA4過表達加劇小鼠創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎的軟骨退變
研究團隊將AAV9-NCOA4注射到小鼠關(guān)節(jié)腔中，實現(xiàn)NCOA4在軟骨中的過表達。兩周后，對小鼠進行DMM手術(shù)或假手術(shù)。DMM手術(shù)小鼠發(fā)生了軟骨退變，表現(xiàn)為蛋白聚糖損失和軟骨糜爛。值得注意的是，與DMM組相比，AAV9-NCOA4注射小鼠更容易發(fā)生DMM引起的退變，其特點是OARSI評分更高。DMM手術(shù)后AAV9-NCOA4處理的小鼠出現(xiàn)了更大的骨贅，骨贅評分更高。以上結(jié)果表明，NCOA4在軟骨中的過表達加速了創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨退變和骨贅的形成。
骨關(guān)節(jié)炎 / 案例4
文章標題：Comparative intra-articular gene transfer of seven adeno-associated virus serotypes reveals that AAV2 mediates the most efficient transduction to mouse arthritic chondrocytes
發(fā)表期刊：PLOS ONE (IF 2.9)
合作客戶：浙江中醫(yī)藥大學(xué)阮紅峰/吳承亮/杜偉斌研究團隊
經(jīng)關(guān)節(jié)內(nèi)注射不同血清型AAV在軟骨組織中的表達
為比較七種常用的AAV血清型（AAV 2、5、6、7、8、9和AAV-DJ）在體內(nèi)對關(guān)節(jié)軟骨的趨性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，研究團隊將等體積的不同AAV血清類型注射到小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。檢測發(fā)現(xiàn)，eGFP在所有注射AAV的小鼠的關(guān)節(jié)軟骨、滑膜和半月板中都有特異性表達；與AAV5/6/7/8/9/DJ血清型相比，關(guān)節(jié)內(nèi)注射AAV2對小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織感染效率更高且特異性更強。
五. 參考文獻
1. Evans CH, Ghivizzani SC, Robbins PD. Gene Delivery to Joints by Intra-Articular Injection. Hum Gene Ther. 2018 Jan;29(1):2-14.
2. Adriaansen J, Vervoordeldonk MJ, Tak PP. Gene therapy as a therapeutic approach for the treatment of rheumatoid arthritis: innovative vectors and therapeutic genes. Rheumatology (Oxford). 2006 Jun;45(6):656-68.
3. Kitase Y, Prideaux M. Targeting osteocytes vs osteoblasts. Bone. 2023 May;170:116724.
4. Yang YS, et al. Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis. Nat Commun. 2019 Jul 4;10(1):2958.
5. Dong Suk Yoon,et al.Cellular and Tissue Selectivity of AAV Serotypes for Gene Delivery to Chondrocytes and Cartilage. Int. J. Med. Sci. 2021.Jul 25;18(15):3353-3360.
6. Shen S, et al. CircSERPINE2 protects against osteoarthritis by targeting miR-1271 and ETS-related gene. Ann Rheum Dis. 2019 Jun;78(6):826-836.
7. Sun K, et al. IRF1 regulation of ZBP1 links mitochondrial DNA and chondrocyte damage in osteoarthritis.Cell Communication and Signaling.2024. 22:366.
8. Sun K, et al. JNK-JUN-NCOA4 axis contributes to chondrocyte ferroptosis and aggravates osteoarthritis via ferritinophagy. Free Radic Biol Med. 2023 May 1;200:87-101.
9. Chen Q, et al. Comparative intra-articular gene transfer of seven adeno-associated virus serotypes reveals that AAV2 mediates the most efficient transduction to mouse arthritic chondrocytes. PLoS One. 2020 Dec 15;15(12):e0243359.
